• I. 서론
• Ⅱ. 재료 및 방법
• 1. 공시재료 및 genomic DNA 추출
• 2. 공시재료의 DNA 동일성 검사
• 3. PCR primer 설계 및 증폭
• 4. SCD1 유전자 878T>C SNP의 유전자형 분석
• 5. 통계분석
• Ⅲ. 결과 및 고찰
• 1. 한우에서 SCD1 유전자의 PCR-RFLP
• 2. 한우 SCD1 유전자의 SNP와 한우 경제형질과의 관련성 분석
• 사 사

I. 서론

 가축에 있어서 대부분의 경제형질은 다양한 유전자의 영향을 받는 것으로 알려졌으며 경제형질에 영향을 미치는 양적형질유전자위(quantitative trait loci; QTL)를 선발한다면 마커도움선발(marker assisted selection; MAS)로써 가축의 개량에 효율적인 사용이 가능할 것으로 예상되어진다. 이에 따라 가축의 경제형질 관련 DNA 마커 발굴은 경제형질과 생물학적으로 연관된 후보유전자를 중심으로 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNP) 발굴 및 통계적 관련성 연구방법을 통하여 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 다양한 형질과 관련된 SNP들이 발굴되었다(Lee 등, 2004; Cheong 등, 2007; Kong 등, 2007; Cho 등, 2008). 또한, 가축의 경제형질과 관련된 유전체상의 연관영역을 검출하고 그 연관영역으로부터 후보 유전자를 선발하는 QTL 연구(Casa 등, 2003; Gutierrez-Gil 등, 2007), 특이 발현 유전자탐색(Lee 등, 2007) 및 proteomics(Hollung 등, 2007) 등 다양한 연구가 진행되고 있다.

 Stearoyl-CoA Desaturase-1(SCD1)는 포유동물에 있어서 불포화 지방산을 합성할 수 있는 율속효소(rate-limiting enzyme)로써 소포체속의 9, 10번 탄소 사이에서 이중결합 상태로 존재한다(Barton 등, 2010; Ntambi 와 Miyazaki 등, 2004). 또한 SCD1 효소는 지방산 acyl-CoA의 cis-9 위치에 있는 cis-이중결합을 촉매 하여 기질인 palmitoyl-CoA(16:0) 와 stearoyl-CoA(18:0)를 체내 대표적 지방저장형태이며, triglyceride의 주요 구성성분으로 전체 불포화 지방산 중 58%를 차지하는 중요한 지방산인 palmitolic-CoA(16:1)와 oleoyl-CoA(16:1)로 전환시킨다(Enoch 등, 1976; Kaestner 등, 1989). SCD1 효소에 의한 불포화지방산으로의 전환반응은 주로 간조직과 지방조직에서 일어나며, 반추위 동물인소에서는 지방조직에서 매우 높게 검출되나 간 조직에서는 활성이 거의 나타나지 않는 것으로 보고되었다(Ntambi, 1995; Lori 등, 1991). 또한 Ikeda(2002) 등은 골격근에서 합성된 triglyceride는 글리코겐과 함께 주요 에너지원으로 사용되어지며, 잉여의 triglyceride는 근육 내 지방으로 근육사이에 저장된다고 보고하였다.

 Bartoň 등(2010)의 연구에 따르면 Fleckvieh 거세우에 있어서 SCD1 유전자는 등심단면적에서 불포화 지방산 축적에 유의성을 보였으며, 또한 이 등(2004)의 보고에 따르면 한우에 SCD1 유전자의 mRNA의 발현은 등심 조직에서 간 조직보다 약 3배 많이 발현되는 것을 알 수 있었다. 하지만 한우에서 SCD1 유전자와 경제형질과의 연관성에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없다.

 따라서 본 연구에서는 103두의 한우집단을 대상으로 PCR-RFLP(polymorphism chain reaction-restriction fragment length polymorphism)방법을 이용하여 SCD1 유전자의 SNP를 확인하고, 아직 보고되지 않은 주요 경제형질과의 연관성을 분석하고자 본 실험을 실시하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료 및 genomic DNA 추출

 축산품질평가원에서 도체성적을 보유하고 있는 2009~2010년까지 도축된 한우 중 103두의 조직시료를 본 연구의 공시축으로 선정하여 실험을 수행하였다. 경제형질 조사항목은 근내지방도(MS, marbling score), 등지방두께(BF, backfat thickness) 등심단면적(LMA, longissimus muscle area), 도체중(CW, carcass weight)의 4개 항목에 대한 측정치를 이용하였다. 각 공시축의 조직시료로부터 약 25 mg의 조직을 떼어난 다음 i-genomic CTB DNA Extraction Mini Kit(Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 추출하였다. 추출한 genomic DNA는 1.5% 아가로스겔 전기영동으로 확인하였으며 분광광도계를 이용하여 DNA농도를 측정한 후 다음 PCR의 주형으로 이용하였다.

2. 공시재료의 DNA 동일성 검사

 본 실험의 공시재료는 도축하고 등급판정을 받은 시료와 실험에 사용된 시료를 MS marker를 이용한 DNA 동일성 검정법(김 등, 2010)에 따라 확인된 시료만 사용하였다.

3. PCR primer 설계 및 증폭

 한우 SCD1 유전자의 exon 5번 영역의 SNP를 분석하기 위해 기존에 보고된 Masaaki 등(2003)이 발표한 878T>C SNP의 Primer sequence를 근거로 Genebank(Accession NW_003104582.1)의 염기서열과 비교하여 1쌍의 primer를 제작하였다(Table 1).

Table.1. Primer information for SNP identification of SCD1 gene in Hanwoo

 PCR 반응을 위해 10X PCR buffer(50 mM Tris-HCl, pH9.0; 15 mM Mgcl2), 1 mM dNTPs, 각 10 pM의 Primer, 50 ng의 genomic DNA 그리고 2.5 U의 Toq DNA polymerase를 첨가하여 최종 반응량이 20 ㎕ 되게 조성하였다. PCR 수행은 GeneAmp^Ⓡ  PCR System 9700(Applied Biosystems, USA)를 이용하여, 최초 95℃에서 5분 동안 예비변성을 시킨 후, 변성반응은 95℃에서 30초 중합 반응은 60℃에서 30초, 그리고 합성반응은 72℃에서 45초 씩 35회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 10분을 수행한 후 종결하였다. PCR이 끝난 후 PCR 증폭산물의 3 ㎕를 1,5% 아가로스 겔에 전기영동하여 증폭여부 및 크기를 확인하였다

4. SCD1 유전자 878T>C SNP의 유전자형 분석

 SCD1 유전자의 SNP 유전자형이 한우에서도 나타나는지 확인하기 위해 PCR-RFLP(restriction fragment length polymerphisms) 방법으로 유전자형을 분석하였다. 총 반응량 20 ㎕에 각 PCR 증폭산물의 10 ㎕와 FastDigest^Ⓡ  Fun4H Ⅰ(Fermentas Life Science, USA) 10 U을 첨가하여 37℃에서 15분 동안 절단 반응하여 이로 얻어진 DNA 절편을 확인하기 위해 ethidium bromide가 포함된 3% 아가로스 겔로 전기영동 하여 각 개체의 유전자형을 결정하였다.

5. 통계분석

 한우 SCD1 유전자에 대한 각 유전자형과 경제형질과의 연관성을 분석하기 위하여 allele frequence는 Cervus Ver. 2.0 program(Marshall 등., 1998)을 이용하였고 통계분석은 SAS 9.2 Package(SAS Institute, USA)를 이용하여 PROC GLM(general linear model) 방법으로 통계분석 하였으며, SNP 유전자형 효과의 유의성이 나타난 형질에 대해서는 Duncan’s multiple range test에 의한 유전자형별 유의성 검정을 실시하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과 같다.

Y_ij  = μ + G_i  + e_ij 

위 식에서,
Y_ij  = 육종가 추정치
μ = 각 육종가의 평균
G_i  = i 번째 SNP 유전자형의 효과
e_ij  = 임의오차를 나타낸다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 한우에서 SCD1 유전자의 PCR-RFLP

 SCD1 유전자는 소 염색체 26번의 21,136,600~21,149,600 bp 사이에 위치하며 5개의 exon(엑손)과 3개의 intron(인트론)으로 구성되어 있다. 본 연구에서는 Masaaki 등(2003)이 발표한 SCD1 유전자의 878T>C SNP정보를 바탕으로 하여 한우에서 SNP을 확인하고 유전적 다형성에 대해 분석하였다. 또한 경제형질과의 연관성에 대해 연구하고 기존의 보고와 비교하였다.

 SCD1 유전자에 대한 PCR-RFLP(polymorphism chain reactionrestriction fragment length polymorphism) 분석을 위해 관련 유전자영역에 특정 염기서열을 포함 하는 primer를 이용하여 PCR 수행 후에 PCR products에 제한효소 Fun4HⅠ(5‘-GC▼NGC-3’)로 절단하여 전기영동 후 제한효소 인지부위의 존재여부에 따라 다형성을 확인하였다(Fig. 1).

Fig.1. The 3% agarose gels electrophoretic patterns of SCD1 gene in Hanwoo.

Genotype: TT=115 and 29 bp; CT=115, 68, 47, and 29 bp; CC=68, 47 and 29 bp

 SCD1 유전자의 Exon 5구역에 있는 SNP를 확인하기 위해 제한효소 Fun4HⅠ처리를 한 결과, FIg. 1과 같이 T 대립 유전자는 115 bp, 29 bp의 단편으로 잘리지 않는 상태로 발현되는 반면 C 대립유전자는 68 bp, 47 bp, 그리고 29 bp로 절단되는 상태로 발현되는 것을 알 수 있었다. 따라서 호모상태의 TT genotype을 가진 개체는 115 bp, 29 bp를 가지는 band 양상을 나타내고 있으며 CT genotype의 이형접합체를 가진 개체는 115 bp, 68 bp, 47 bp, 그리고 29 bp를 보이며 CC genotype은 호모상태로 68 bp, 47 bp, 그리고 29bp의 band 양상을 보였다.

 각각의 실험 결과로 얻어진 SCD1 878T>C SNP에 대한 유전자형 및 대립유전자(allele)의 빈도는 Table 2에 제시하였다. Bartoň 등(2010)이 보고한 총 370마리의 Fleckvieh 거세우를 이용한 실험에서 유전자형 빈도는 CC형에서 0.322, CT형에서 0.468, 그리고 TT형에서 0.211로 나타났으며 본 연구에서 한우 103마리를 제한효소 Fun4HⅠ으로 처리한 유전자형에 있어서 각각의 빈도는 CC형은 0.252, CT형의 빈도는 0.563 그리고 TT형의 빈도는 0.184로 관찰되어 앞선 연구결과와 비슷한 결과를 보여주었다. 또한 한우집단에서 유전자 빈도를 살펴보면 C 대립유전자 빈도가 0.534로 나타났으며 T 유전자 빈도(0.466) 보다 높게 나타나는 것을 볼 수 있었다.

Table.2. Genetic characteristics, genotype and allele frequencies of 878T>C SNP in SCD1 gene in Hanwoo

 독일 자국의 고유 소품종인 Fleckvieh 소의 SCD1 유전자의 878T>C SNP의 대립유전자 빈도는 C 대립유전자는 0.555로 T 대립유전자 빈도는 0.444로 나타난 것을 볼 수 있었으며 일본 흑우 에서는 C 대립유전자에서 0.59로 T 대립유전자 에서는 0.41로 나타나 본 연구와 매우 유사한 결과를 나타내었다.

 이번 실험에 사용된 한우 집단의 878T>C SNP genotype에 대한 기대이형질성(expected Heterozygosity; Exp.)은 0.500으로 나타났고 관찰이형질성(observed Heterozygosity; Obs.)은 0.563으로 나타나 비슷한 결과를 보였으며 다형성의 정보량을 보여주는 PIC(polymorphic information contents)값은 0.374로 나타났다.

2. 한우 SCD1 유전자의 SNP와 한우 경제형질과의 관련성 분석

SNP와 도체형질과의 연관성 분석을 위해 동일성 검정 결과 도축장 시료와 동일한 결과를 보인 개체만 선택하여 실험에 이용하였으며, 도체형질 측정치는 축산물 품질평가원에서 제공받아 사용하였다. 또한 각 형질별 최댓값 최솟값 및 평균을 Table 3에 제시하였다.

Table.3. Means standard error (SE) and extreme values of phenotypic values measured on carcass traits in Hanwoo

 근내지방도(MS)는 1에서 9까지의 다양한 측정치를 나타냈으며 평균값은 5.03으로 나타났다. 등지방두께(BF)의 평균 값은 10.20 mm로 최댓값, 최솟값은 각각 2 mm, 26 mm으로 나타났으며, 등심단면적은 32 cm² 에서 가장 작은 수치를, 136 cm² 에서 가장 큰 수치를 평균값은 86.10 cm² 를 나타냈다. 도체중(CW)는 166~510 kg사이에서 수치가 나타났고 평균 373.76 kg의 수치를 나타내었다.

 한우에 있어서 SCD1 유전자의 878T>C SNP이 경제형질에 있어서 미치는 영향을 분석하게 하였고, 축산물 품질평가원에서 제공받은 도체형질의 표현형 측정치와 각 SNP의 유전자형간의 통계적 분석은 PROC GLM(general linear model)을 이용하였다(Table 4).

Table.4. Association of 878T>C polymorphisms with economic traits of SCD1 gene in Hanwoo

 분석에 사용된 103마리의 한우에 있어서 SCD1 878T>CSNP은 도체중(CW)에서 유의적인 차이가 관찰되었으나 (p<0.05), 다른 경제형질에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 유의적인 차이를 보인 도체중(CW)은 TT genotype 에서 평균 417.79 kg의 수치를 나타내 CC genotype(371.08 kg), CT genotype(360.53 kg)보다 더 높은 측정치를 나타내었다. 또한 유의적인 차이를 나타내진 않았지만 배최장근단면적(LMA)과 등지방두께(BF)에서 각각 TT genotype(88.05cm² )과 CC genotype(10.54 mm)이 다른 유전자형에 비해 보다 높은 측정치를 가짐을 나타냈으며, 근내지방도(MS)의 경우에는 CT genotype(5.53)에서 높은 측정치를, Homo genotype끼리 비교에서는 CC genotype(4.69)이 높은 측정치를 나타냈다.

 최근 소의 육질개량의 측면에서 QTL연구는 경제형질에 있어서 중요한 요소로 여겨지고 있으며, core binding factor, runt domain, α subunit 2, transloacted to 1(CBFA2T1)은 근내지방도(Marques 등, 2008), exostion 1(EXT1)은 근내지방도, 등심단면적 및 등지방두께(Kim 등, 2011)와 관련성이 있다고 보고되었으며 이 외에도 많은 유전자들이 경제형질과 관련성 연구가 진행되고 있다.

SCD1 유전자는 현재까지 소의 간과 등심지방에서 불포화지방의 합성에 관여하는 것으로 알려져 있으나(Bartoň 등, 2010; 이 등, 1999; 이 등, 2004), 아직까지 한우에서 SCD1 gene의 SNP와 경제형질과의 연관성에 대해서는 보고되지 않았다. 따라서 본 연구를 통해 SCD1 유전자의 878T>C SNP이 도체중과 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한SCD1 유전자에서 다른 경제형질과의 연관성을 찾기 위해 추후 지속적인 연구가 필요할 것으로 보이며 추가적인 유전자의 SNP 발굴 및 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다

사 사

 본 연구는 강원도 농업기술원 특화작목연구개발과제(과제번호: 120110184)와 농촌진흥청 차세대 바이오그린21 사업(과제번호 PJ008196)으로 이루어 졌으며 이에 감사드립니다.