• Ι. 서론
• Ⅱ. 재료 및 방법
• 1. 관절 연골세포의 분리 및 배양
• 2. 봉독이 연골세포에 미치는 영향, 배양 및 봉독 처리
• 3. RNA추출 및 Microarry분석
• Ⅲ. 결론 및 고찰
• Ⅳ. 요약
• 사사

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Ι. 서론

 퇴행성관절염 이라고도 불리는 골관절염(osteoarthritis)은 성인에서 흔하게 발생하는 대표적인 근골격계 질환이며, 골관절염은 연골하부와 골소주 및 관절연골의 대사로 발생하며, 관절연골의 국소적인 퇴행성 변화, 연골하골의 비야, 주변 골연골부의 과잉 골형성 관절의 변형등과 함께 심한동 통과 심각한 운동장애를 동반한다(Bang 등, 2007, Altman 등). 이러한 골관절염의 주요 치료방법으로는 체중조절, 물리치료, 하지근육 운동치료 등의 비약물치료와 함께 acetaminophen 혹은 비스테로이드성 소염진통제류(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)의 복용의 약물치료, 관절치환술과 같은 수술요법 등이 사용되고 있다(Noh 등, 2004, Lee 등 1996). 하지만 NSAIDs는 골관절염 환자의 통증 완화를 위해 가장 많이 사용되고 있지만 장기간 사용했을 시 위장관 부작용이 증가하는 단점이 있어 적극적인 질병치료 수단으로서는 미흡한 점이 많으며 통증완화로써 작용하고 있어 치료 수단으로는 미흡한 점이 많다.

 한편 천연물질은 예로부터 민간요법으로 이용한 사례가 많았으며 화학적 약물과 달리 장시간 약물투여로 인한 부작용이 적은 장점이 있어 최근 인공합성물 보다 이를 이용한 신약개발에 관해 많은 연구가 진행되고 있다.

 특히 봉독은 대표적인 천연물질로 알려져 왔으며 관절염, 통풍 등 각종 염증성 질환과 통증성 질환에 활용되어 왔다(Dunn 등, 1988, Wang 등, 2001). 또한 봉독의 효능에 대해서는 다양한 연구가 진행되어 왔으며 관절염과 관련된 분야에서는 진통 및 항염증 효과가 많이 연구되고 있으며(Jang 등, 2005, Nam 등, 2003), 이외에도 각종 신경성, 타박성, 소화기 질환뿐만 아니라 암과 에이즈에 이르기까지 다양한 질환에서 봉독의 항염증 및 항균효과에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다(An 등, 2012). 하지만 현재까지 봉독 효능에 대한 연구가 상당히 진행되어 왔으나 아직 봉독이 연골세포 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구는 봉독이 연골세포 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 돼지연골 세포를 대상으로 microarray방법을 통해 유전자 발현 양상을 알아보고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 관절 연골세포의 분리 및 배양

 연골채취를 위한 실험동물로는 돼지(Sus scrofa)를 사용하였고, 뒷다리 슬 관절 부위를 삭모 및 소독하였으며 모든 작업은 무균상태에서 진행하였다. 피부절개를 가한 후, 연골막을 제거하고 연골을 채취하여 serum-free DMEM(Dulbeco‘s Modified Eagle’s Medium) 용액에 보관하였다. PBS용액으로 2-3회 세척한 후 hyaluronidase을 첨가한 DMEM media를 넣어 잘게 chopping한다. 상층액을 제거한 후 protease으로 37℃에서 60분간 incubation한 후 처리된 연골을 1,500 rpm, 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하여 PBS용액으로 세척하였다. Type Ⅱ collagenase을 37℃에서 약 2시간30분 배양한 후 같은 방법으로 처리하여 연골세포를 얻었다. 얻어진 세포를 혈구계로 세포수를 세어 20% FBS(fetal bovine serum Gibco:26140-038)와 antibiotics가 포함된 DMEM 배양액에 37℃, 5% CO₂ 하에서 3일 초대배양하였다. 분리된 연골세포의 동정은 배양 후 3일째 도립현미경으로 세포의 형태학적 특징을 관찰하였다.

2. 봉독이 연골세포에 미치는 영향, 배양 및 봉독 처리

 배양된 세포를 flask에 seeding한 후 세포단층이 형성되도록 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양한 후 serum-free DMEM으로 배양액을 교환하면서 대조군과 봉독을 투여할 실험군으로나누었다. 대조군에는1 ㎍/㎕의lipopolysaccharides가 포함된 배지에서 배양되었으며, 실험군에는 20 mg/ml의 농도의 봉독을 포함한 DMEM배지에서 배양되었다.

3. RNA추출 및 Microarry분석

 Total RNA는 RNeasy mini kit(Qiagen, Hiden, Germany)을 이용하여 자사의 protocol에 따라 추출하였다. 유전자 발현은 Genechip^Ⓡ Procine Genome Arrays(Affymetrix, Snta Claara, CA)의 23,973개의 probe를 이용하여 확인하였다. DNA chip의 scanning은 Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7 G를 사용하였다. DNA chip의 제작과 분석은 GenoCkeck co., Ltd.(Korea)에서 수행하였다.

Ⅲ. 결론 및 고찰

 봉독이 돼지 연골세포에 미치는 영향을 확인하기 위해서 Affymetrix사의 porcine genome array genechip을 이용하여 약 23,973개의 probe에서 유전자 발현을 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Gene expression

 유전자에서 봉독에 의해 발현이 1.5배 이상 발현차이를 나타낸 유전자는 약 2,235개로 분석되었으며, log intensity를 이용하여 발현차이를 나타내는 유전자들의 수를 각 단계에 따라 Fig. 2에서 확인하였다. X축은 비교, 대조군의 log2 ratio를, Y축은 해당 log intensity를 나타내는 유전자의 수이며 가운데 두 라인을 제외하고 다른 부분의 유전자수가 유의적인 발현차이를 나타내었다. 비교 결과 발현양이 증가된 유전자(up-regulated gene)가 1404개, 발현양이 감소된 유전자(down-regulated gene)가 831개로 분석되었다. 이 발현양이 증가된 유전자 중 밝혀진 유전자(up-regulated known gene)는 372개, 발현양이 감소된 유전자 중 밝혀진 유전자(down-regulated known gene)는 237개로 나타냈으며, 이 중 발현이 2배 이상 차이를 나타낸 유전자를 Table 1과 2에 제시하였다. 유전자 발현이 2배 이상 증가한 유전자는 68개 발현이 2배 이상 감소한 유전자는 62개로 나타났으며 이 중 가장 높은 발현을 나타낸 유전자는 MYL1(myosin, light chain 1)으로 가장 감소된 발현을 나타낸 유전자는 RPLP1(ribosomal protein, large, P1)으로 나타났다.

Fig. 2. Intensity ratio histogram of bee venom-treated versus control

Table 1. Expression profiling of the up-regulated gene in the bee venom-treated chondrocyte

Table 1. Continued

Table 1. Continued

Table 2. Expression profiling of the down-regulated gene in the bee venom-treated chondrocyte

Table 2. Continued

Table 2. Continued

 porcine gene ontology(GO) 정보를 이용하여 분석한 결과 372개의 up-regulated known gene 중 GO function이 밝혀진 유전자는 131개로 나타났으며, GO molecular function은 112개, Go cellular component은 84개, GO biological process은 102개로 밝혀졌다. 또한 237개의 down-regulated known gene 중 GO function이 밝혀진 유전자는 139개로 나타났으며, GO molecular function은 128개, GO cellular component은 102개, GO biological process은 110개로 밝혀졌다.

 fetuin은 간에서 생성되는 당 단백질로 급성 염증반응에 관여하며 봉독 처리된 연골세포에서 대조군에 비해 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 봉독의 항염증 작용으로 예상되어 지며 이러한 결과들을 미루어 보면 봉독은 연골세포의 항염증작용에 있어 영향을 미치는 것으로 예상되어 진다.

 기존의 연구로 인해 증명된 봉독의 기능으로는 항암, 진통, 면역기능증가 등의 효과가 있으나(Gi 등 1998, Lee 등 2003), 연골세포를 이용하여 봉독의 소염 진통효과에 대한 연구는 아직 미미한 상태이다. 본 연구에서는 봉독의 효과를 microarray방법을 이용하여 검정하였으며 염증작용에 연관된 유전자에서 감소되는 것을 볼 수 있었다. 따라서 봉독은 연골세포의 항염증작용에 영향을 미치는 것으로 예상되어 지며 본 연구 결과는 봉독의 발현 프로파일링의 기초자료로 사용될 것으로 사료된다. 또한 앞으로 RT-PCR 및 western blotting방법을 이용하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

사사

 본 연구는 한국연구재단 신진연구지원사업(과제번호:120120392)와 농촌진흥청 차세대 바이오그린21 사업(과제번호 PJ008196)으로 이루어 졌으며 이에 감사드립니다.