• Ι. 서론
• Ⅱ. 재료 및 방법
• 1. 시약
• 2. 실험용 mouse
• 3. 미꾸라지 근육단백질 가수분해물의 제조
• 4. In vitro 항산화 활성 측정
• (1) 전자공여능
• (2) Superoxide radical 소거능
• 5. In vivo 항산화 활성 측정
• (1) 시험군
• (2) 간독성 및 혈청 총 항산화능의 측정
• 6. 통계처리
• Ⅲ. 결과 및 고찰
• 1. In vitro 항산화 활성
• 2. In vivo 항산화 활성
• 3. In vitro 와 in vivo 활성의 연관성
• Ⅳ. 요약
• 사사

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Ι. 서론

 동물식품에 존재하는 항산화 물질은 두 가지 측면, 즉 다른 영양소의 안정화 및 인체에 미치는 유용한 기능을 제공한다는 관점에서 매우 중요하다(Samaranayaka와 Li-Chan, 2011). 예를 들면, 식품 자체 내에 항산화물질이 존재하면 지질의 산화나 지질산화에 따른 2차 생성물의 형성을 방지함으로써 저장 중 지질성분으로부터 유래하는 식품의 풍미, 질감 또는 색감을 유지할 수 있게 해 준다. 또한 산화성 물질이 유발하는 단백질의 carbonyl물질의 생성을 억제함으로써 단백질의 안정성 유지에 기여 한다(Elias 등, 2008). 따라서 우유, 두류, 계란 또는 어류에서 발견되는 항산화 작용을 가진 단백질이나 단백질 분해물들은 이들 식품의 보존성을 연장시키는 것으로 알려져 있다(Hagen과 Sandness, 2004; Peňa-Ramos와 Xiong, 2003; Sakanaka와 Tachibana, 2006).

 한편 이러한 항산화 펩타이드 성분들을 식품으로 부터 섭취하였을 때 인체내에 세포내 항산화능의 유지에 기여하게 된다(Niki, 2010). 인체는 건강한 상태에서도 반응성 산소종들(예, ·OH, ·OOR, O₂-·, ONOO- 등)을 끊임없이 생산하고 있으며 이들은 충분한 세포내 항산화성 방어기전(주로 산화성물질 분해 효소계나 비타민 및 아미노산 등의 산화성물질 소거능을 가진 저분자 물질 등)이 존재되지 않으면 세포나 조직의 손상이 초래된다(Halliwell과 Gutterridge, 1999). 그 결과 특히 노화 시, 환경오염몰질 오염, 과로, 영양과잉, 고지방섭취 등의 과정에서 산화성 기전-항산화 기전 간의 균형이 파괴됨으로써 다양한 질병이 유발된다.

 동물성 식품에서 발견되는 단백질 유래 항산화물질들의 섭취는, 과도한 산화성 물질의 생성에 기인한 질병인 암, 간조직 손상, 피부 노화 등을 억제할 수 있는 가능성 때문에 오래 전부터 많은 관심을 끌어 왔다. 특히 수산동물의 단백질로부터도 항산화 효과가 보고되어 있다. 즉, 챠넬메기(channel catfish), 청어(herring), 가다랑어(bonito), 명태(Alska pollack), 참치(tuna), 정어리(sardine), 붕장어(congereel), 열빙어(capelin), 고등어(mackerel), 남방대구(hoki), 백연어(chum salmon), 흑점줄전갱이(travally)와 같은 다양한 해산어, tilapia, 초어(grass carp), 미꾸라지(loach) 등의 담수어류, 또한 패류(굴 및 홍합)이나 연체동물(대왕오징어) 등의 다양한 종류의 수산둥물에서 알려져 있다(Samaranayaka와 Li-Chan, 2011).

 미꾸라지(loach)는뱀장어, 잉어, 송어등과 함께 우리나라에서 많이 소비하는 담수어종으로 우리나라 외에도 중국, 일본, 대만 등에서 자연계에 분포 또는 인공 양식되고 있다. 우리나라에서 식용으로 소비되는 미꾸라지류는 엄밀하게 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)와 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus), 또 이들의 잡종으로 구성(Yang 등, 1994)되어 있으며, 식품으로는 사용시에는 특별한 구분 없이 동일하게 취급되고 있다. 현재 이 세 가지의 종류 중 총 소비량은 중국으로부터의 수입으로 인해 미꾸라지가 압도적으로 많은 것으로 추정되고 있다. You 등(2009; 2011a; 2011b)은 최근 미꾸리(M. anguillicaudatus) 근육단백질을 효소로 가수분해하여 3,000 Da이하의 크기를 가진 peptide fraction을 분리하고 in vitro에서의 항산화효과를 증명한 바 있다. 또한 미꾸리의 점액성분인 polysaccharide에서도 항산화작용을 가진 성분이 존재한다(Qin 등, 2001; 2002).

 식품에 함유된 항산화 성분의 약효평가에서는 in vivo system에서 효과가 증명되어야만 비로소 그 식품을 인간이 섭취하였을 때 실제로 약효가 발휘된다고 주장할 수 있을 것이다(Collins, 2005; Griffiths 등, 2002). 특히 비타민과 같은 저분자 항산화물질들과는 달리, 분자량이 보통 500-1,500 Da범위에 해당하는 어류 유래 peptide의 경우에는 위장관내 분해나 낮은 세포막 통과능으로 인해 경구 흡수율을 보장할 수 없으므로 동물시험에서의 약효 나아가서는 인체에서의 임상효과 증명이 필요하다. 그러나 어류 유래 peptide성 물질의 항산화 활성을 평가한 이들 연구의 대부분은 in vitro에서의 시험결과이며 in vivo에서 그 효과를, 특히 경구투여에 따른 효과를 평가한 것은 전혀 없다.

 본 연구에서는 미꾸라지(M. mizolepis) 근육단백질 가수분해물의 항산화 효과를 in vitro 및 mouse에서의 in vivo효과를 측정하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시약

 Xanthine oxidase, Trolox, nitroblue tetrazolium(NBT), quercetin, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid(ABTS), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 및 2,6-dihydroxipurine(xanthine)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, total protein 분석용 kit, glutamate-oxaloacetate transaminase(GOT) 및 glutamatepyruvate transaminase(GTP) 활성측정용 kit는 (주)아산제약(경기도)에서 구입하여 사용하였다. Flavourzyme은 Novo(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하였고, 항산화양성대조물질인 ascorbic acid는 Daia-Koban, Osaka, Japan에서, 간장독성물질 carbon tetrachloride(CCl₄)는 Junsei(Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다.

2. 실험용 mouse

 웅성 specific-pathogen free ICR계 mouse(17 g 전후)를 다물사이언스(대전)에서 구입하여 실험실에서 1주일간 순치시킨 후 시험을 개시하였으며 전 기간 중 사료와 물은 충분히 공급해 주었다. 사육온도는 22±2℃, 상대습도는 55±10%로 유지시켜주면서 12시간 주기로 소등과 점등 및 소등을 하였다. 1주일에 한번 씩 bedding을 교환하였다.

3. 미꾸라지 근육단백질 가수분해물의 제조

 미꾸라지는 남원시의 한 양식장에서 생산한 소비단계의 체중에 도달한 순수종(마리당 18 g 전후)을 공급받아 사용하였다. 문헌(You 등, 2009)에서 항산화활성이 보고된 시료와 동일하게 처리를 하였다. 즉, 미꾸라지의 피부를 제거한 후 근육만을 분리하여 10배량(w/v)의 증류수에 균질화하고 2 N NaOH를 이용하여 pH 11.0으로 맞춘 다음 냉장고(3℃)에서 20분간 보관하였다. 이 시료를 4℃에서 1,600☓g로 30분간 원심분리(VS-21SMT model, Vision Scientific, Gyeonggi-Do)하여 상층액을 취하여 2 N HCl로 pH 5.5로 조정한 다음 냉장고에서 20분간 보관한 후 다시 원심분리(1,600☓g, 20분, 4℃)하여 침전물을 효소 가수분해용 시료로 사용하였다. 효소 가수분해 처리는 시료의 단백질 농도가 50 mg/ml가 되도록 조정한 뒤 flavourzyme을 단백질 함량의 1%가 되도록 가하고 50℃에서 12시간 동안 shaking incubator에서 반응시켰다(Raghavan과 Kristinsson, 2009). 가수분해물은 원심분리(1,600☓g, 20분, 4℃)하여 상층액(AE 시료, alkali and enzyme hydrolysis, 주로 분자량 26.1 및 37.8 kDa와 소량의 61.5 kDa 로 구성)만을 사용하였다.

 별도로 비교를 위해, 분리한 생근육을 증류수에 균질화한 후 직접 flavourzyme으로 위와 동일하게 효소 처리한 시료(E, enzyme hydrolysis), 균질화 후 30분간 끓인 시료(B, boiling) 및 끓인 시료를 다시 flavouzyme으로 가수분해한 시료(BE, boiling and hydrolysis)를 조제하였다. 제조한 시료는 -70℃에 보관하면서 시험 전에 증류수로 희석하여 사용하였다.

4. In vitro 항산화 활성 측정

(1) 전자공여능

 Free radical 생성물질 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)가 전자나 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하여 자색이 탈색되어지는 원리를 이용하여 측정하며 Wu 등(2003)의 방법을 사용하였다.

(2) Superoxide radical 소거능

 Superoxide radical 소거능은 superoxide를 dismutation 반응에 의해 H₂O₂를 소거하는 효소인 superoxide dismutase(SOD)의 활성측정법(McCord 및 Fridovich, 1969; Packer, 1990)을 응용한 xanthine/xanthine oxidase의 효소반응에 의한 superoxide 발생계와 nitroblue tetrazolium(NBT) 법을 이용하였다(Kim 등, 1996).

5. In vivo 항산화 활성 측정

(1) 시험군

 ICR는 총 40 마리를 사용하여 시험하였다. 대조군과 in vitro 시험에서 가장 우수한 활성을 보여준 시료인 AE(alkaline and enzymatic hydrolysis) 10% 첨가 군, CCl₄ 군, AE+CCl₄군 및 대조군으로 군 당 10 마리씩 총 4개 군으로 나누어 시험하였다. Mouse에는 설치류용 AIN-76A diet(사료 kg당 casien 200, corn starch 150, DL-methionine 3, cellulose 50, sucrose 250, dextrose 250, AIN-76A mineral mix 35, AIN-76A vitamin mix 10, choline bitartrate 2, corn oil 50 g 포함)을 대조군에, AE군에는 casein 200 g 중 절반은 AE 시료 100 g으로 대체하였다. 이 사료를 4주간 연속 투여한 후 간독성을 유발하기 위해 mouse에 사염화탄소(CCl₄)를 복강 내로 투여 하였다. 액상인 CCl₄를 corn oil에 15%가 되도록 혼합한 용액을 체중 30 g당 0.1 ㎖의 volume으로 투여하였다.

(2) 간독성 및 혈청 총 항산화능의 측정

 사염화탄소 투여 24시간 후 ether 흡입마취 후 혈청 및 간장을 취하였다. 혈청은 안와정맥을 통해 채취한 혈액을 실온에서 30분간 방치하여 응고시킨 후 원심분리(3,500☓g, 30분, 3℃)한 후 혈청만을 분리하여 사용하였다. 간장독성의 지표인 혈청 중 glutamate-trasnaminase(GOT) 및 glutamatepyruvate transaminase(GPT)활성도를 측정하기 위하여 Reitman과 Frankel(1957)에 따라 아산제약 분석 kit를 사용하였다. 혈청 중의 총 항산화능력은 Re 등(1999)의 방법에 따라 Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)를 측정하였다.

6. 통계처리

 Data는 평균±표준편차로 표현하였다. 시험군간의 차이 비교는 one way analysis of variance를 이용하여 검정한 후 개별군 간 차이의 통계학적 유의성은 Student-Newman-Keul‘s test를 이용하여 판단하였다. p<0.05 수준일 때 유의성이 있다고 판정하였다. In vitro 시험에서 50% 저해효과(IC₅₀) 계산을 위해 Graphpad Prism(Verson 4, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 사용하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. In vitro 항산화 활성

 Fig. 1에서는 서로 다르게 처리한 시험물질의 in vitro 시험계에서의 항산화능을 보여주고 있다. In vitro 시험계의 하나인 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl)가 생성한 free radical을 소거하는 능력을 측정하는 시험(Fig. 1A)에서는 각 군마다 약간의 차이는 있지만 시험한 4종의 모든 시료가 유사한 농도 의존성 항산화능을 보여주고 있다. 즉 이 시험에서의 저해능의 정도(IC₅₀ , mg/ml)는 각각 끓인 시료(B) 5.5 mg/ml, 생근육의 효소처리(E) 4.7 mg/ml, 끓인 후 효소처리(BE) 4.1 mg/ml 및 알칼리 및 효소처리(AE) 4.3 mg/ml임이 관찰되었다. 반면에 xanthine-xanthine oxidase를 시용하여 생산한 superoxide radical 소거능 시험(Fig. 1B)에서는 알칼리가수분해와 효소분해를 병행한 시료(AE)나 생근육을 효소분해한 시료(E)들은 DPPH radical 소거능의 경우보다 다소 둔감하면서도 농도의존성 항산화능(AE, IC₅₀ =21.3 mg/ml)을 보이지만 단순하게 끓이거나(B) 끓인 후 가수분해를 행한 시료(BE)는 항산화활성을 거의 발휘하지 못하였다(IC₅₀>30 mg/ml). 이 결과는 DPPH 시험계가 아주 빈번하게 사용되는 항산화능 시험방법이기는 하지만 위양성반응(false positive)이 많이 나타나는 단점을 가진 사실에 기인하는 것으로 보인다(Ragubeer 등, 2010). You 등(2009)은 본 연구에서 시험한 어류와 매우 유사한 근연종인 미꾸리(M. anguillicaudatus)의 근육으로부터 DPPH radical 소거능을 보고한 바 있다. 이 연구에서는 우리나라의 미꾸라지 소비의 상당량은 탕(추어탕)의 형태로 이용되고 있기 때문에 단순히 끓이기만 하였을 때에도 항산화 활성이 나타나는지도 평가하고자 하였다. 그러나 superoxide radical 소거반응 결과를 보면, 끓인 근육을 효소 가수분해하여 측정한 경우에는 생근육을 가수분해한 것보다 항산화효과가 낮았기 때문에 끓이는 과정에서 항산화 효과가 일부 소실된다고 판단된다.

Fig. 1. In vitro anti-oxidant effects of loach protein and peptides.A. DPPH radical scavenging activity (n=5). B. Superoxide radical scavenging activity (n=3); B. boiled, E: enzymatic hydrolysis, BE: boiled and enzymatic hydrolysis, AE: alkaline and enzymatic hydrolysis. Under the same condition, ascorbic acid at 1.6-25 μg/ml exhibited DPPH radical scavengeing activity of from 18.6±5.0 and 95.4±5.5% in a concentration dependent manner (IC50 =4.6 μg/ml); Quercetin at 20-50 μg/ml also produced superaoxide radical scavenging activity of from 8.2±5.2 to 73.6±8.3%(IC50=35.7 μg/ml) also in a concentration-dependent manner.

2. In vivo 항산화 활성

 시험물질의 in vivo 활성 측정에 사용한 평가방법은 mouse에 사염화탄소(CCl₄)를 투여하여 유발한 동물실험 모델을 사용하였다. 사염화탄소(CCl₄)를 동물에 투여하였을때 발생하는 동물에서의 간장독성은 화학물질에 의한 free radical의 생성으로 인한 in vivo 독성 모델로서 가장 잘 알려진 실험모델의 하나이다(Recknagel과 Glende, 1973). 동물체내에서 약물대사 효소계(cytochrome P₄₅₀)는 사염화탄소로부터 trichloromethyl radical(CCl·₃)과 peroxytrichloromethyl radical (-OOCl·₃)을 생성하며 이 강력한 반응성 물질들이 세포막의 고도불포화지방산에 결합하여 간장의 세포막 손상을 유발한다(Weber 등, 2003). 따라서 간장세포의 손상에 따라 세포괴사의 지표인 혈정 내 transaminase인 GOT 및 GPT활성의 증가, 지질과산화물(lipid peroxide)의 증가, 또는 총항산화능의 감소가 보고되어 있으며, 이 지표들은 항산화작용을 평가하기 위한 측정지표l로 널리 사용되고 있다(Hung 등, 2006).

 이 연구에서는 각 군 mouse혈청의 GOT, GPT 및 혈청 총 항산화활성의 활성을 비교한 결과 AE 10% 투여군과 대조군에 차이가 없어 시험물질 자체는 간장 기능에 아무런 영향을 미치지 않음이 관찰되었다(Table 1). 한편 사염화탄소의 투여로 인해 현저한 간장독성이 나타남이 간장 상대중량의 증가(염증), 혈청 transaminase 효소의 증가와 혈청 총 항산화능(TEAC)의 감소 등에서 관찰되고 있다. 그러나 in vitro시험에서 항산화효과가 있다고 판단된 단백질 분해물(AE)을 4주간 연속적으로 투여한 후에도 사염화탄소에 의해 유도되는간장독성을저감하지 못함이이 GOT 및 GPT 활성, 총항산화능, 간장상대중량의 변화 모두에서 관찰되었다.

Table 1. Effects of loach muscle protein hydrolysate on CCl4-induced hepatotoxicity in mice

3. In vitro 와 in vivo 활성의 연관성

 본 연구에서는 미꾸라지 근육단백질 가수분해물의 항산화능력을 평가하고 생체 내에서도 그 효과가 있는지를 알아보기 위해 in vitro와 in vivo 시험을 병행한 점이 중요한 의의를 갖는다. In vitro 평가시험은 DPPH radical 소거능과 superoxide radical 소거능을 측정하였으며 적어도 효소로 분해한 시료 및 알칼리처리와 효소처리를 모두 행한 시료는이 두 in vitro 시험계에서 활성이 있음을 확인하였다.

 그 결과에 따라 두 중류의 in vitro 항산화 시험 model에서 모두 확실한 활성을 보인 alkali 및 효소분해물(AE)을 mouse에 장기간 투여하고 항산화능이in vivo에서도 확인되는지 평가하였다. 그러나 in vitro 시험계에서와는 달리 in vivo 활성을 확인하는 데에 실패하였다.

 식품에 함유된 성분의 항산화 활성 평가에서 실험동물에 투여되었을 때in vivo에서 효과를 확인하는 과정은 매우 중요하다. 이 연구에서 평가한 mouse의 1일 섭이량은 체중 g 당 72 mg 정도의 가수분해물(실험의 중간지점에서 체중 31.5±2.1 g과 시험시료 섭취량 228±5.2 mg 이었으며 이에 근거하여 228 mg/31.5 g=72.4 mg/g 로 산출)로써 이 양전체가 일시에 흡수된다고 가정하면 전신중의 농도(균질하게 분포한다고 가정할 때)는 72 mg/ml로서 in vitro 시험에서 활성이 있는 수준을 훨씬 능가한다. 그러나 이러한 조건에서 mouse에서는 항산화활성이 확인되지 않았다. 동물성 식품 단백질을 이용한 지금까지의 연구에서 발견되는 대부분의 in vitro 항산화 활성 peptide는 분자량 500-1,500 Da의 범위에 속한다(Samaranayaka와 Li-Chan, 2011). 그러나 이 정도의 분자량을 가진 분자들은 장점막의 투과 및 흡수가 극히 제한적이므로 섭취 후 전신에 도달할 가능성이 매우 낮다. 오히려 장내(lumen)에서만 항산화 작용을 발휘하거나, 만약 전신 순환계에 도달한다면 장점막에 존재하는 수용체와 결합한 후 세포내 흡수(pinocytosis)를 통해 전신에 도달해야 할 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서 발견된 in vitro와 in vivo 시험결과의 불일치성에 대하여 그 이유를 여러 가지로 추정해 볼 수 있으나, 비록 가수분해를 통해 흡수도를 증가시키려고 시도하였지만 현재의 조건에서 전신으로 흡수되는 물질의 양이 충분하지 않았다고 판단된다.

 현재까지 동일한 시험 물질에 대하여in vitro 및in vivo시험을 동일한 논문에서 비교 · 수행한 시험이 극히 소수만이 발견되고 있다(Anderson과 Phillips, 1999; Rimbach와 Pallauf, 1998). 연구자들이 별개로 수행한 시험들을 분석하면 in vitro에서 활성이 발견된 물질이 in vivo에서는 무효한 것이 흔히 발견된다(Andersson 등, 2007; Fardelt 등, 2007; Lewis 등, 1996; Rimbach와 Pallauf, 1998; Xia 등, 2006). 이 연구에서는 in vivo에서 활성이 발견되지 않았지만 시험계의 조건을 변화시키면서 추가적인 연구를 수행한다면 유용성을 발견할 수 있는 가능성은 남아 있다.

사사

 본 연구는 2012년도 군산대학교 수산과학연구소 학술연구비 지원에 의하여 수행되었으므로 이에 감사드립니다