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Ⅰ. 서론

 최근 소비자들이 웰빙식품에 대한 관심이 높아지면서 육류의 소비 경향에 있어서도 양보다 질을 선호하는 경향이 강해져 우수한 육질의 고급육이 요구되어지고 있는 추세다. 또한 최근에 축산물 수입 개방으로 인한 값싼 수입 쇠고기와의 경쟁력을 키우기 위해서는 한우의 도체 품질을 높이는 것이 우선적으로 요구되는 실정이다. 따라서 한우의 고급화를 위한 육질과 육량을 증가 시키는데 중점을 두고 유전자 마커와 관련된 연구가 진행되고 있다.

 국내 쇠고기의 도체 품질 중 육질을 결정짓는 도체 특성으로는 육색, 지방색, 근내지방도 및 조직감 등으로 결정지어 진다. 대체적으로 육질은 살코기 사이에 지방이 어느 정도 함유되어 있는지를 나타내는 근내 지방도가 높아짐에 따라 소비자들이 섭취 했을 때 다즙성 및 풍미 등이 좋다고 알려져 있다. 따라서 한우의 고급육 생산을 위해 근내 지방도 함량을 높이는 유전자 마커를 이용하여 고기의 육질을 향상시키는 것을 중점으로 연구되어 지고 있다(신기현 등, 2009).

 Fatty Acid Binding Protein 4(FABP4) 유전자는 지방조직에서 발현되며, Peroxisome Proliferator-Activated Receptors(PPAR)와 상호작용을 하여 Hormone-Sensitive Lipase (HSL)과 결합한다고 알려져 있으며 세포내 지질대사와 항상성에 있어서 중요한 유전자로 알려져 있다(Damcott 등, 2004). 이러한 FABP4 유전자는 호르몬감수성 지방질가수분해효소와 직접적인 상호작용으로 붙게 되어 지질의 가수분해작용과 세포내 지방산을 수송한다고 보고되어 있다(Shen 등, 1999). 또한 쥐에서 FABP4유전자는 비만과 관련된 후보유전자로 알려져 있다(Ogino 등, 2003). 특히 백색 지방세포에서 분비되는 16 kDa 단백질인 렙틴은 음식물 섭취의 조절, 에너지 소비, 몸 전체의 에너지 균형과 연관되어 있기 때문에 FABP4 유전자가 지방세포의 항상성과 지질대사에 있어서 매우 중요한 유전자임을 알려주고 있다(Jiang과 Gibson 등, 1999). Michal 등(2006)의 연구에 따르면 Wagyu x Limousin F2 교잡우에서 FABP4 유전자변이는 육질향상과 관련된 근내 지방도와 피하지방 두께에서 유의적인 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 한우 거세우와 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP이 도체중(p<0.01), 근내지방도 (p<0.001) 그리고 배최장근 단면적(p<0.001)의 세 가지 경제형질과 관련된 도체형질에서 유의적인 연관성이 있는 것으로 나타났다(Lee 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 지방세포와 관련된 FABP4 유전자를 대상으로 칡소 및 흑소에서 육질향상 및 양적형질에 있어서 효과가 있는지 알아보기 위해 유전자형 분석과 PCR-RFLP(Polymerase chain reaction-Restricted Fragment Length Polymorphism) 방법을 통해 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)을 확인하고 분석하여 도체형질과의 연관성을 통계적으로 분석하였고, 이 연구를 통하여 칡소와 흑소의 육우 선발에 있어서 중요한 DNA marker로써 활용될 수 있는지 밝혀내고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료, 도체형질자료 및 DNA 추출

 본 연구에 사용된 공시재료는 축산물품질평가원에서 2010년 09월부터 2012년 03월까지 도축된 117두의 칡소와 한반도 내륙에서 사육한 24두의 흑소의 조직시료를 사용하였다. 도축하고 등급판정을 받은 고기시료는 MS(microsatellite) marker를 이용한 DNA 동일성 검정법을 통해 개체가 확인되었다. 또한 경제형질 비교 분석을 위한 경제형질 관련 도체형질로는 도체중(carcass weight; CW), 배최장근 단면적(longissimus muscle area; LMA), 등지방두께(backfat thickness; BF), 근내지방도(marbling score; MS)등 4가지 항목에 대한 자료를 이용하였으며 각 개체에 대한 도체정보는 축산물품질평가원에서 판정한 결과를 활용하였다.

 Genomic DNA는 제공받은 칡소 및 흑소의 조직시료 25 mg을 떼어낸 후 i-genomic CTB DNA Extraction Mini Kit(Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 DNA를 추출 및 정제하였다. 추출된 DNA는 PCR을 하기 위하여 분광광도계로 260 nm~280 nm에서 흡광도를 측정을 하여 농도와 순도를 확인하였다.

2. PCR-RFLP를 통한 FABP4 유전자 SNP의 유전자형 분석

 본 연구에서는 칡소와 흑소의 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP과의 연관성분석을 위한 실험을 하기 위해 Michal 등(2006)의 논문에서 보고된 g.7516G>C SNP의 primer sequence를 GenBank(Accession No. NC_007312.4)에서 재차 확인 한 후 PCR을 실시하였다(Table 1). DNA 증폭을위한 PCR 기계는 GeneAmp^® PCR System 9700(Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며 Top DNA polymerase (Bioneer, Korea)를 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR을 위한 첨가물 조건으로는 Genomic DNA 50 ng, primer 0.01uM, 0.15 mM의 dNTP, 15 mM MgCl2/mL를 포함한 10X PCR buffer 1.5 ㎕, 그리고 Taq DNA polymerase 5 U을 넣고 최종산물이 20 ㎕가 되게 조성하였다. 반응 조건으로는 최초 94℃에서 5분간 예비변성을 한 후 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 중합반응, 72℃에서 30초간 합성반응을 50번 반복하였고 최종 72℃에서 10분간 합성 후 PCR을 종결하였다. 증폭된 산물들은 1.5% agarose gel에서 50 mv 전압으로 30분간 전기영동을 하여 증폭여부 및 크기를 확인하였다.

Table 1. Sequence of the forward (F) and reverse (R) primers used for the amplification of FABP4 gene regions

 기존 발표된(Michal 등, 2006) Wagyu x Limousin F2 종에서 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP에 대한 다형성이 칡소 및 흑소의 유전자에서도 나타나는지 확인하기 위하여 증폭산물을 제한효소로 절단하여 확인하였다. 제한효소 처리를 위해 PCR증폭산물 10 ㎕, MspA1I(Promega, USA) 5U, 10X Buffer 2 ㎕, Acetylated BSA 0.2 ㎕를 넣고 총량이 20 ㎕가 되도록 하였다. 만들어진 mixture는 37℃에서 총 3시간동안 활성화 시켜 PCR증폭산물을 절단한 후 절단된 DNA 단편 확인을 위하여 1.5% agarose gel에서 100 V에서 2분간, 50 V에서 50분간 전기영동하여 절단된 DNA 절편양상을 분석하여 유전자형 확인을 하였다.

3. 통계분석

경제형질과 관련된 성적에 대한 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP의 유전자형 분석에서 allele frequency는 Cervus Ver. 2.0 program(Marshall 등, 1998)을 이용하였고 통계분석은 SAS 9.2 Package(SAS Institute, Inc. Cary, NC, USA)를 이용하여 PROC GLM 방법으로 통계 분석하였으며, SNP 유전자형 효과의 유의성이 나타난 형질에 대해서는 Duncan's multiple range test에 의한 유전자형별 유의성 검정을 실시하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과
같다.

Y_ij =μ+G_i+Ma_j+ℰ_ij

 여기서, Y_ij는 도체형질 관측치, μ는 형질의 전체평균, G_i는 유전자형 효과, Ma_j는 측정 나이의 회귀변수, ℰ_ij는 임의오차를 나타낸다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

 Casas 등(2003)의 연구에 의하면 Bos indicus와 Bos taurus 교잡종 집단에서 소의 14번 염색체에서 마블링 등의 QTL과 유의적인 연관성을 나타냈다. 또한 Michal 등(2006)의 연구에 따르면 Wagyu x Limousin F2 종에서 FABP4 관련 SNP이 근내지방도(p<0.05)와 피하지방두께(p<0.05)에 있어서 유의적인 상관관계를 나타냈다. 최근에는 한우에서 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP과 연관성분석을 한 결과 도체중(p<0.01), 근내지방도(p<0.001) 그리고 배최장근 단면적(p<0.001)의 세 가지 경제형질 관련 도체형질과 유의적인 상관관계가 나타난 것으로 보고되었다(Lee 등, 2012). 본 연구에서는 이전에 밝혀진 Michal 등(2006)이 발표한 FABP4 유전자에서 발견된 g.7516G>C SNP에 대한 정보를 기초로 칡소와 흑소에서 SNP을 확인하고 유전적 다형성과 경제형질관련 도체특성간의 연관성을 통계 분석하였다.

FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP를 분석하기 위해 실험에 사용된 개체별 소의 도체형질 자료인 배최장근 단면적(LMA), 도체중(CW), 등지방두께(BF), 근내지방도(MS)의 4가지 항목에 대한 정보를 이용하여 FABP4 유전자의 SNP과의 연관성을 분석하는데 참고하였다(Table 2). 유전자형을 알아보기 위하여 PCR-RFLP 방법을 이용하여 각 절편으로 절단하여 개체별 유전자형 차이를 확인하였다. 제한효소 MspA1I은 G>C 돌연변이가 일어나는 특정 서열을 인식하게 되어 각각의 절편으로 잘라지게 되며, 절편의 길이는 CC genotype이 452 bp, CG Genotype이 452 bp, 352 bp, 100 bp로 나누어지며, GG genotype은 352 bp, 100 bp로 나누어지게 된다(Fig. 1). 

Table 2. Means, standard deviation (SD) and extreme values of phenotypic values measured on carcass traits in brindle and black cattle

Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of MspA1I-PCR-RFLP. GG genotype shows two fragments (352 bp and 100 bp), CG genotype shows three fragments (452 bp, 352 bp and 100 bp), and CC genotype shows one fragment (452 bp).

 전기영동결과로 칡소와 흑소 FABP4 유전자의 SNP 유전자형을 결정하여 유전자형 출현빈도를 분석하였다(Table 3). 같은 위치의 SNP을 연구한 Michal 등(2006)이 보고한 Wagyu x Limousin F2 종에서 유전자형 빈도는 CC genotype에서 59.51%로 가장 높게 나타났으며 GG genotype에서 9.05%로 가장 낮게 나타났다. 또한 Pannier 등(2010)이 보고한 9품종의 소에서 유전자형 빈도를 분석한 결과 7 품종(Limousin, Friesian, Simmental, Hereford, Belgian Blue, Blonde d’Aquitaine, Salers)의 소에서 CC genotype이 평균 66.5%로 가장 많았으며, CG genotype이 28.0%, GG genotype이 5.4%로 가장 낮게 나타났음을 알 수 있었다. 그러나 나머지 2 개의 품종(Charolais, Angus)에서는 CG genotype이 가장 많은 58.3%를 나타냈으며, CC genotype이 30.7%, GG genotype이 11.0%로 나타났다. 본 연구에서는 칡소와 흑소의 CC genotype이 각각 59.83%, 54.17%로 가장 높으며 GG genotype이 각각 2.56%, 4.16%로 가장 낮게 나타나 앞의 연구결과와 유사한 genotype frequency가 나타났음을 알 수 있었다.

Table 3. Allele and genotype frequencies for the SNP in FABP4 gene in brindle and black cattle

 칡소와 흑소 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP가 도체형질에 영향을 주는지 알아보기 위하여 도축 자료와 PCR-RFLP방법으로 분석한 genotype 자료를 이용하여 SAS 9.2 Package(SAS Institute, Cary, NC, USA)로 통계분석을 하였다.

분석에 이용된 117두의 칡소에서 FABP4의 g.7516G>C SNP과 관련된 도체특성으로는 도체중(p=0.041)과 유의적인 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Table 4). 분석된 칡소의 genotype과 도체중과의 연관분석 결과 CG genotype의 평균치가 380.02 kg으로 CC genotype의 평균 347.49 kg과 GG genotype의 평균치 362.67 kg 보다 높은 평균치를 보였다(p<0.001). 

Table 4. Association of the bovine SNP in fatty acid binding protein 4 gene (g.7516G>C) with carcass traits in brindle cattle

 그러나 흑소 집단에서 FABP4의 g.7516G>C SNP과 도체특성의 연관성 분석을 한 결과 4개의 도체특성에서 유의적인 상관관계 확인할 수 없었다(Table 5).

Table 5. Association of the bovine SNP in fatty acid binding protein 4 gene (g.7516G>C) with carcass traits in black cattle

 Michal 등(2006)의 연구는 232두 Wagyu x Limousin F2종의 FABP4 g.7516G>C 실험에서 GG genotype의 근내지방도에서 다른 유전자형의 근내지방도보다 더 높은 유의성을 나타내었으며(p=0.0398), 피하지방두께에서 CC genotype이 0.378인치로 CG genotype의 0.428인치와 GG genotype의 0.418인치보다 낮은 유의성을 나타내었다(p=0.0246). 또한 Lee 등(2012)의 연구에서 319두의 한우 거세우와 도체특성의 연관성 분석을 한 결과 도체중과 배최장근 단면적, 그리고 근내지방도에서 모두 CC 유전자형이 우월한 형질을 가지는 것으로 유의적인 연관성이 나타났다.

 본 연구 결과로 미루어 볼 때 칡소에 있어서 FABP4 유전자의 g.7516G>C SNP는 도체중에서 CG genotype이 우월한 것으로 나타나 기존 보고된(Michal 등, 2006) 연구에서 나타난 우월한 근내지방도를 가지는 유전자형인 GG genotype과는 다르게 나타난 것을 알 수 있었다. 또한 CC genotype이 우월한 도체형질을 가진다고 나타난 한우 거세우에서의 연구(Lee 등, 2012)와 비교 해 보았을 때 칡소에서는 CG genotype이 우월한 형질을 가지는 것으로 나타나 한국 재래종인 두 종간에도 차이점이 있는 것으로 나타났다.

 이종 간(individual population)의 동일 유전자의 SNP이 도체특성에 영향을 미치고 있지만 서로 다른 도체형질에 영향을 주는 것으로 보아 Bos taurus 내에서 지방생성 및 지방산 수송과 관련되어 여러 가지 도체형질에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 이로 미루어보아 Bos taurus 내에서도 서로 다른 종간에 동일한 유전자의 SNP이 영향을 미치는 도체특성은 차이가 있을 것으로 사료된다. 따라서 하나의 DNA marker로 여러 가지 종에서 종 특이적인 선발 마커로써 이용할 수 있는 가치가 높을 것으로 사료된다.

 FABP4 유전자는 현재 소 뿐만 아니라 다른 동물에서도 지방생성 및 지방산 수송과 관련 된 것으로 알려져 있다(ogino 등, 2003). 또한 Wagyu X Limousin F2 종(Michal 등, 2006) 에서도 FABP4 유전자의 SNP이 지방생성과 관련된 도체형질에서 유의적인 상관관계가 있는 것으로 나타났지만 아직까지 칡소 및 흑소에서는 FABP4 유전자의 SNP과 경제형질 관련 도체특성과의 연관성에 대해서는 보고된 바가 없었다. 동물에서는 약 200만개의 SNP이 밝혀지면서 품종의 특성, 개체의 특성을 규명할 수 있게 되었다(Kim 등, 2008). 후보 유전자를 이용한 선발효과의 효율성을 향상시키기 위해서는 한우와 칡소 및 흑소의 더 많은 개체군을 대상으로 한 추가연구가 필요하며 한우의 경제형질에 영향을 미치는 다수의 추가적인 후보유전자의 SNP을 발굴하여 비교 및 분석 할 필요가 있으며 향후 본 유전자의 SNP과 상호작용하는 그 외의 경제형질에 영향을 주는 다른 후보유전자의 SNP에 대한 추가 발굴과 연구를 통한 한우선발 DNA marker로써 발전시킬 필요가 있을 것으로 요구된다.

사사

 본 연구는 농촌 진흥청 차세대 바이오그린21 사업(과제번호 PJ008196, PJ008028)으로 이루어 졌으며 이에 감사드립니다.