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Ⅰ. 서론

쇠고기의 육질(meat quality)을 결정하는 주된 요인은 연도, 조직감, 육색 그리고 고기에 함유된 지방의 조성과 분포도 등 다양한 형질에 의해 결정된다(De Vol 등, 1988). 최종적으로 쇠고기의 품질을 판정하는 소비자들의 생활수준의 향상과 서구화된 식생활로 인하여 쇠고기의 소비가 날로 증가하고 있으며 고급육에 대한 요구 또한 증가 하는 추세이다. 소비자의 선호도를 충족시키기 위한 고급육 개발 및 지역 브랜드의 차별화는 반드시 필요한 과제이며 한국 축산업의 큰 발전과 더불어 한우의 경쟁력 향상의 주요 척도가 될 것이다. 최근 EU, 미국, 호주 등과의 FTA(free trade agreement)로 인한 한국의 쇠고기 시장의 완전개방으로 수입쇠고기의 유통이 활발해 지면서 우리나라 축산을 대표하는 한우산업에 큰 위협이 되고 있지만 아직까지 뚜렷한 대응방안은 제시되고 있지 않다. 때문에 수입쇠고기와는 완전히 다른 소비영역을 확보할 수 있도록 한우의 고유 유전자원의 식별, 유지, 보존 및 개량을 위한 첨단 기술 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

 최근 분자 생물학적 기법이 다양하게 발달하면서 다양한 분야에서 활용되고 있다. 가축에서 경제형질에 영향을 미치는 주요 유전자(Quantitative trait locus, QTL)의 특성에 관한 연구가 가속화 되면서 분자 육종에 의한 가축 개량이 점차 확대되고 있으며(Lee 등, 2007), SNP(Single nucleotide polymorphism)에 의해 개체간의 형질이 다르게 나타나는 유전적인 변이에 대한 관심이 높아지고 있다(Lee 등, 2004; Cheong 등, 2007; Cho 등, 2008; Kim 등, 2009). 이미 선진국에서는 가축에서 육질 및 도체형질에 영향을 주는 후보유전자(Candidate gene)와 이들과 관련된 유전자의 DNA Marker 개발에 관한 연구가 적극적으로 추진되어 근내지방도(Marbling), 연도(Tenderness), 육색 및 지방색(Meat and fat color) 등과 같은 육질형질에 대한 유전적 표지인자(Gene marker)와 양적형질좌위간의 연관성에 관한 연구가 상당히 진행되어왔다(Beever 등, 1990; Andersson 등, 1994; Bishop 등, 1995; Bovenhuis 등, 1997). 따라서 한국의 축산업을 대표하는 전통가축(한우, 칡소, 흑우)에서 유전적인 다형성과 구성의 이해는 차후 우수한 유전능력 검증과 품종개량을 위해서 반드시 필요하다. Melanocortin-4 receptor(MC4R) 유전자는 G-protein coupled membrane receptor의 일종으로 영양섭취 및 에너지 대사와 관련한 신호전달(signal transduction)을 중재하며, leptin 호르몬과 반응하여 인간을 비롯한 척추동물에서 비만과 연관된 유전자 중 하나로 알려져 있다(Gantz 등, 1993; Huszar 등, 1997; Ho와 MacKenzie, 등, 1999; Farooqi 등, 2003; Qiu 등, 2006).최근까지 많은 선행연구를 통하여 인간에 있어서 MC4R 유전자와 에너지 대사작용 및 지방축적과 연관성이 보고되었으며(Kim 등, 1999), 가축에 있어서도 MC4R 유전자는 가축의 경제형질(체중, 성장률, 근내 지방도 및 등지방 두께), 생체 에너지 대사 및 지방대사와 관련하여 많은 연구가 진행되어 왔다(Kim 등, 2004). 또한, Liu 등, 2010; Zhang 등, 2009; 등 연구결과에서 중국의 Qinchuan cattle과 Nanyang cattle으로 연구한 MC4R 유전자의 다형성 연구에서 경제형질(도체중, 생체중, 지방두께, 일당증체량 및 근내지방도)과 성장형질(일당증체량, 생체중) 사이의 연관성 결과가 보고되었으며, 최근 보고 된 Seong 등, 2011의 연구에서 한우의 MC4R 유전자와 경제형질(Backfat, Marbling sore)과의 연관성을 확인하였다. 하지만 지금까지 칡소와 흑우를 대상으로 MC4R 유전자가 어떠한 경제형질에 영향을 미치는지에 대한 연구는 보고되지 않았다. 따라서 본 실험은 총 125 마리의 칡소와 흑우에서 MC4R 유전자 2번째 인트론 부위에 존재하는 SNP C1786T 변이와 경제형질(등지방 두께, 평균일당증체량 및 근내지방도, 도체중) 사이의 연관성을 확인하는 것이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료

 본 연구에서 사용된 공시재료는 생후 24~36개월 사이의 소들로 축산물품질평가원에서 조직시료를 제공받았다. 경제형질 조사 항목으로는 배최장근단면적(longissimus muscle area), 등지방두께(backfat thickness), 근내지방도(marbling), 도체중(carcass weight), 육량지수(meat quantity index) 등 5개의 항목에 기록된 측정치를 사용하였으며, 각 개체의 도축정보와 개체정보는 축산물품질평가원과 종축개량협회, 농협의 축산정보 홈페이지에서 제공되는 정보를 활용하였다.

2. Genomic DNA 추출

공시축의 조직시료로부터 25 mg을 떼어내고 파쇄기를 이용하여 분쇄하였으며 I-genomic CTB DNA Extraction Mini kit(Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 제시한 protocol에 따라서 DNA를 추출하였다. 추출한 genomic DNA는 1.5%의 아가로스 겔에서 전기영동을 사용하여 확인하였으며 분광광도계를 사용한 다음 PCR의 주형으로 이용하였다. 

3. MC4R 유전자 Primer 및 설계

 한우 MC4R 유전자의 SNP 실험을 위해 기존에 보고된 (Seong 등, 2011)의 논문에서 SNP C1786T의 Primer sequence를 확인하여 Genebank(Accession No. AC_000159.1)에서 확인하였으며, 실험에 이용된 SNP C1786T primer 쌍의 염기서열 정보는 Table 1에 제시한 바와 같다.

Table 1. Primer information for SNP identification of MC4R gene in brindle and black cattle

4. MC4R 유전자의 PCR 증폭

두 집단에서 MC4R 유전자의 SNP C1786T 실험을 하기 위하여 Table 1에 제시된 프라이머를 사용하여 총 125개의 DNA sample을 PCR 실험 하였다. PCR 반응에는 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem, USA)을 사용하였으며 PCR 반응액 조성은 다음과 같다. DNA 50 ng, Taq polymerase 0.5 U, dNTP / PCR buffer은 각 0.25 mM /10X(MgCl₂)로 사용하였으며, D.W.를 포함한 총 볼륨(volume)은 20 ㎕으로 하였다. PCR cycle 조건(condition)은 최초 94℃에서 4분간 pre-denaturation을 한 다음 94℃에서 30초 denaturation, 56.4℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초 extension, 마지막으로 72℃에서 10분간 final extention을 35 cycle 수행하였다. 예상된 allele size가 존재하는지, PCR 조건의 적정성 여부를 확인하기 위하여 1.5% TBE agarose gel로 UV상에서 전기영동 하여 477 bp 크기의 증폭 산물을 확인하였다. 

5. 유전자형 분석

 MC4R gene SNP C1786T의 절단부위(allele)를 결정하기 위하여 제한효소(TaaI)를 사용하였다. 총 볼륨 20 ㎕에 제한효소(TaaI) 0.5 U를 첨가하여 65℃에서 1시간동안 처리한 다음 1.5% agarose gel에 전기영동을 실시하여 유전자형을 결정하였다(Table 2).

Table 2. Restriction enzymes for PCR-RFLP of the MC4R gene SNP C1786T

6. 통계분석

 PCR-RFLP를 통하여 MC4R 유전자 SNP C1786T가 한우(거세우)의 주요 경제형질과의 영향을 미치는 효과를 규명하기 위하여 후보유전자와 경제형질간의 상관관계를 SAS 9.2 Pakage(SAS institute, Inc. Cary, NC, USA)를 이용하여 PROC GLM 방식으로 통계분석 하였다. SNP 유전자형 효과의 유의성이 나타난 형질에 대해서는 Duncan’s multiple range test에 의한 유전자형별 유의성 검정을 실시하였다.
통계분석에 이용한 모형은 다음과 같다.
Y_ij= μ + G_i + e_ij

위 식에서,
Y_ij = 육종가 추정치
μ = 각 육종가의 평균
G_i = I 번째 SNP 유전자형의 효과
e_ij = 임의오차

Ⅲ. 결론 및 고찰

1. MC4R gene SNP C1786T의 genotyping

 MC4R 유전자에 대한 PCR-RFLP(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) 분석을 위해 MC4R SNP C1786T의 염기서열을 포함하는 Primer를 이용하여 PCR과정을 수행한 후 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 PCR product를 확인하였으며, 확인된 PCR product에 제한효소 TaaI를 사용하여 절단한 후 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 절단부위의 존재여부에 따라 유전자형을 확인하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Agarose gel (1.5%) electrophoresis of TaaI PCR-RFLP. TT genotype shows one fragments (404 bp), CT genotype shows three fragments (404, 279, 125 bp) and CC genotype shows two fragments (279, 125 bp).

 Table 3은 칡소와 흑우에서 PCR-RFLP를 사용하여 집단 내 SNP 유전자형 출현율과 대립유전자 빈도를 조사한 결과를 제시하였다. 본 연구에서는 칡소 104마리, 흑우 21마리를 사용하여 실험하였으며, 칡소의 genotype 비율은 CC 45.2%로 가장 높은 빈도를 나타냈으며, CT(42.3%), TT(12.5%) 순으로 나타났다. 칡소의 결과와 대조적으로 흑우의 genotype 빈도는 CT가 47.60%로 가장 높게 나타났으며, TT(38.10), CC(14.30) 순의 빈도를 보였다.

Table 3. Genetic characteristics, genotype and allele frequencies of 1786C>T SNP in the MC4R gene in Korean brindle and black cattle

 한우를 이용한 Seong 등(2011)의 선행연구에 따르면 CC, CT, TT genotype에서 각각 57.6%, 39.3%, 3.1%순으로 흑우의 결과와 빈도적인 차이는 있었지만 칡소의 결과와는 유사한 패턴을 보였다. 본 실험에 사용된 칡소와 흑우 집단의 1786C>T SNP genotype에 대한 기대이형질성(expected heterozygosity; Exp.)은 칡소에서는 0.499, 흑우에서는 0.483으로 나타났고, 관찰이형질성(observed heterozygosity Obs.)은 칡소에서 0.423, 흑우에서 0.476였다. 다형성의 정보량을 보여주는 PIC(polymorphic information contents)값은 칡소와 흑우가 각각 0.347과 0.360로 나타났다.

2. 칡소와 흑우의 MC4R 유전자 SNP와 경제형질과의 관련성 분석

 MC4R 유전자 SNP C1786T와 경제형질과 관련성을 분석하기 위해 개체별로 측정된 총 125마리의 칡소와 흑우의 육질 및 도체형질은 축산물 품질평가원 홈페이지를 참고하였으며 분석에 이용된 공시재로의 도체형질의 최대값과 최소값을 Table 4에 제시하였다.

Table 4. Means, standard error (SE) and extreme values of phenotypic values measured on carcass and meat quality trait in Korean bridle and black cattle

 근내지방도(MS)는 1-9까지 등급사이의 측정치를 나타냈으며 평균 측정치는 칡소(5.86), 흑우(4.90)으로 나타났다. 등지방두께(BF)의 평균값은 칡소 9.86 mm, 흑우 14.43 mm의 수치를 보였으며, 평균 등심단면적(LMA)은 칡소 79.41 cm², 흑우 82.05 cm² 이었다. 육량지수(MQI)는 68.184-[0.625×등지방두께(mm)]+[0.130×배최장근단면적(㎠)]-[0.024×도체중량(㎏)](단, 한우 도체는 3.23 가산)으로 산출하였으며, 칡소의 평균치는 67.56, 흑우 63.75였다. 도체중(CW)의 최소값와 최대값은 각각 칡소 232 kg에서 525 kg, 흑우 282 kg에서 509 kg 범위였고, 평균치는 각각 333.68 kg, 387.71 kg로 였다.

총 125마리의 칡소와 흑우에서 MC4R SNP C1786T와 주요 도체형질에 미치는 영향을 확인하기 위하여 연관분석을 하였고 그 결과를 Table 5에 제시하였다. 

Table 5. Least square mean and standard error for economic traits of the MC4R in brindle and black cattle

 칡소의 SNP과 도체형질간의 연관분석 결과, 등지방두께(BF), 육량지수(MQI)와 유의적인 차이를 확인하였다(p<0.05). 등지방 두께(BF)는 CT genotype에서 평균 11.25 cm로 다른 유전자형들에 비해 높게 나타났으며, CC 8.87cm, TT 7.85 cm 순이었다. 육량지수(MQI)에서는 TT genotype이 평균 68.47로 나타나 CT 66.01, CC 67.65보다 높았다. 칡소에서의 결과와는 다르게 흑우에서는 등심단면적(LMA)에서 유의적인 차이를 보였으며, CC genotype에서 평균 85.88 cm²로 CT 83 cm², TT 68.67 cm² 에 비해 높았다(p<0.05). 유의적인 차이는 나타나지 않았지만, 칡소에서 등심단면적(LMA)과 도체중(CW)은 CT genotype에서 높은 평균치를 보였고, 근내지방(MS)은 CC genotype에서 높은 평균치를 보였다. 흑우 또한 유의적인 차이는 나타나지 않았지만, 근내지방(MS)와 육량지수(MQI)가 CT genotype에서 높은 평균치를 보였고, 등지방두께(BF)와 도체중(CW)은 CC genotype에서 높은 평균치가 나타났다.

 (Seong 등, 2012)의 선행연구에서 한국을 대표하는 한우(황우)에서 MC4R gene과의 경제형질(BF, MS)과의 연관성을 확인하였다. 하지만, 칡소와 흑우에서 MC4R gene의 SNP과 경제형질과의 연관성은 본 실험에서 처음으로 보고하는 것이다. 따라서 본 연구의 결과는 MC4R gene SNP C1786T 이 칡소에서 등지방두께(BF)와 연관성을 발견할 수 있었으며, 흑우에서는 등심단면적(LMA)과 연관성을 확인할 수 있었다. 현재 칡소와 흑우는 복원사업이 진행 중이며, 또한 일정 지역에서만 사육되고 있어서 sample 확보에 큰 어려움이 있다. 때문에 추후 더욱 많은 개체군을 통한 추가적인 경제형질과의 연관성을 찾는 연구가 기대되며, MC4R 유전자 SNP 1786C>T는 칡소 및 흑우를 선발함에 있어 중요한 후보유전자 마커로 사용될 것으로 사료된다.

사사

본 연구는 농촌진흥청 차세대 바이오그린21 사업(과제번호: PJ008196, PJ008028)으로 이루어 졌으며 이에 감사드립니다.