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Ⅰ. 서론

 틸라피아는 짧은 기간 동안 6-10℃의 저온에서도 잘 견디며 35-42℃ 범위의 고온에서도 적응능력이 빠른 열대 어종으로 알려져 있다. 대체로 20℃와 35℃ 사이에서 성장이 이루어지며 반면에 37℃ 이상의 수온에서는 사망률이 증가하는 것으로 보고되고 있다(Fast, 1986). 틸라피아는 주변 환경의 변화에 강한 어종이지만 병원균에 감염되기 쉬운 고온이나 저온에서 스트레스를 받을 수도 있다. 일반적인 병원성 미생물 중 flexibacteria는 고온이나 저수온의 조건에서 피부조직의 염증을 유발시키며 Ichthyophthirius 및 Trichodina와 같은 원생생물과 림포시스티스 바이러스 등은 저수온에서 피부에 흰 반점을 발생시킨다(Paperna, 1996; Chavijo 등, 2002). 틸라피아를 포함한 많은 양식담수어 종에 있어서 Streptococcus iniae의 박테리아 감염은 심각한 수준이다(Shoemaker와 Klesius, 1997; LI와 Gatlin III, 2003). S. iniae에 감염된 어류는 외형상 특이할 만한 특징 없이 체중감소와 더불어 대량폐사에 이르게 되는데 틸라피아가 바로 이 박테리아에 가장 감수성이 높은 어종 중의 하나이다(Perera 등, 1994; Shoemaker와 Klesius, 1997). 그러므로 수온변화의 스트레스가 어류의 면역체계와 감염성 미생물에 대한 감수성에 어떠한 영향을 미치는가가 주요관심의 대상이 되고 있다(Anderson 등, 1984).

 다양한 활성산소 종류(reactive oxygen species, ROS)들은 세포의 호흡폭발 과정 중 생산된다. 일단 박테리아나 곰팡이 등이 백혈구에 의해 탐식되면 주세포의 NADPH 산화효소가 활성화되며 순차적으로 산소소비를 촉진시키고 이어서 superoxide anion(O₂^-), hydrogenperoxide(H₂O₂), hydroxylradical(·OH) 및 singlet oxygen(¹O₂)등이 부산물로 발생된다(Roch, 1999). 호흡폭발 과정에서 생산된 활성산소는 그것의 유도체와 더불어 박테리아의 사멸효과가 있는 것으로 알려져 있다(Secombes와 Fletcher, 1992). 점막과말초혈액 및 특정 조직에서 발견되는 라이소자임은 박테리아 세포벽에 존재하는 펩티도글리칸의 N-acetyl muramic acid와 N-acetyl glucosamnine 결합을 가수분해하는 효소이다(Jolles와 Jolles, 1984). 이러한 효소는 경골어류에 있어서 박테리아의 감염을 예방하는 선천성 방어인자로 작용하며 비 특이적 체액성 면역반응의 일종인 보체의 우회경로는 염증유발, 화학주성 및 옵소닌 활성을 높여준다(Ellis, 1999).

 담수어에 있어서 수온의 변화는 살해세포의 활성, 대식세포의 활성, 호흡폭발 및 백혈구의 수치 등에 영향을 미친다고 잉어(Cyprinus carpio)를 대상으로 한 연구결과에서 보고되고 있다(Le Morvan-Rocher 등, 1995; Le Morvan-Rocher 등, 1996; Le Morvan-Rocher 등, 1997; Kurata 등, 1997; Engelsma 등, 2003). 수온의 변화는 또한 틸라피아의 IgM의 합성수준과 라이소자임의 활성 및 대식세포활성에도 영향을 미친다고 보고되었다(Chen 등, 2002; Dominguez 등, 2004; Dominguez 등, 2005).

 본 연구는 틸라피아(Oreochromis niloticus)에 저온 및 고온의 수온변화를 주었을 때 S. iniae의 공격감염에 대한 저항성의 변화와 비 특이적 면역지표로서 호흡폭발(활성산소의 생성), 대식세포 활성, 라이소자임 활성 및 보체의 우회경로에 미치는 영향 등을 조사하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 실험어

 틸라피아(Oreochromis niloticus)는 35±4.3 g(mean±SD) 중량의 크기로서 약 250마리를 국립군산대학교 양어장에서 분양 받았으며 지하수가 담긴 원형수조에 산소공급을 하면서 27℃에서 약 2주간 순치시켰다. 공격실험에 있어서 실험군과 대조군의 수조에 각각 총 10마리씩 수용하고 16, 25 및 36℃에서 시간별로 나타나는 치사율을 3회 반복 측정하였다. 비 특이적 면역지표를 위한 실험에서는 16, 25 및 36℃에 대응하는 서로 다른 노출시간인 0, 12, 24, 48 및 96시간에 맞는 총 15개의 그룹을 설정하였다. 각 그룹의 수조에 5마리씩 수용한 다음 2회씩 동일하게 반복하여 실험을 수행하였다. 실험이 진행되는 동안 하루에 2회씩 일정량의 사료(CJ 제일제당)를 공급하였다.

2. 포르말린 처리된 Escherichia coli

 E.coli(DH5a)는 tryptic soy broth(TSB) 100 ㎖에 분주한 후 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 포름알데하이드 50%용액을 최종농도 2% 되게 박테리아 배양액에 넣은 후 20℃에서 교반 시키면서 하루 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 박테리아 펠릿을 50 ㎖의 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2)으로 2회 세척한 후 동량의 PBS를 넣어 재 부유 시킨 후 대식활성 실험을 위해 냉장 보관하였다.

3. 호흡폭발 분석

 PBS 5 ㎖에 zymosan(Sigma) 50 ㎎이 들어 있는 부유액을 뚜껑이 있는 유리 tube에 넣어 30분간 100℃의 수조에서 자주 교반 시켜주었다. 그 후 500×g에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 펠릿을 10 ㎖의 토끼혈청(Sigma)에 재 부유 시켜 30℃에서 30분간 배양시킨 후 5분간 500×g에서 재차 원심분리 하였다. Zymosan 펠릿을 PBS 10 ㎖로 2회 세척한 후 1 ㎎/㎖농도로 조정한 후 본 실험을 위해 4℃에서 보관하였다.

4. S. iniae의 배양

 병원성이 있는 것으로 확인된 S. iniae는 국립수산과학원으로부터 분양 받아 TSB(Difco Lab, MD)배지로 26℃에서 하루 동안 충분히 배양한 후 540 nm에서 OD 1.2수치로 맞추어 1×10⁸ cfu/㎖ 의 부유액으로 조정하였다. 그 후 200㎕ 씩 분주하여 deep freezer에 보관하면서 필요시마다 꺼내어 사용하였다.

5. S. iniae에 대한 틸라피아의 감수성에 미치는 수온의 영향

 공격실험은 틸라피아를 50 L의 물이 들어있는 60 L 수조에 5가지의 수온(16, 25 및 36℃)별로 각각 10마리씩 넣은 후 총 3회 반복하였다. 각 틸라피아의 복강으로 100 ㎕ 씩 S. iniae 2×10⁷수로 주입되었다. 대조군으로는 S. iniae가 없는 TSB의 동량을 각 수온조건에 할당된 틸라피아에 주입된것으로 하였다. 각 수조에서 나타나는 치사율은 7일에 걸쳐 관찰되었으며 3회 반복된 실험군의 평균치를 누적 폐사율로 표현하였다.

6. 면역지표에 미치는 수온의 영향

 총 25개의 실험군 16, 25 및 36℃의 수온 별로 조합된 서로 다른 5개의 노출시간이 적용되었다. 효소활성 분석을 위해 틸라피아 5마리씩을 실험군 별로 20 L 용 수조에 수용하고 2회 반복 수행하였다. 실험어는 0.02% benzocaine용액으로 마취하였으며 각 혈액 샘플은 헤파린이 처리된 주사기로 미정맥에서 채취하였다. 혈장을 혈액으로부터 분리한 후 추후 라이소자임과 보체활성 분석에 사용하기 위해 냉동저장 하였다.

7. 백혈구의 분리

 혈액 0.5 ㎖을 0.5 ㎖의 PBS에 희석한 후 50% Percoll(Sigma)을 이용하여 400×g에서 15분간 원심분리 하여 중간층에서 백혈구를 분리하였다. 혈구 계산판으로 분리된 백혈구의 생존율을 계산하고 95% 이상 되는 세포들을 실험에 사용하였다.

8. 비 특이적 면역세포 반응 측정

 백혈구의 호흡폭발 수치는 nitroblue tetrazolium(NBT)이 superoxide anion(O₂^-)에 의해 formazan으로 환원되는 원리를 이용하여 측정하였다(Chung과 Secombes, 1988). 호흡폭발은 100 ㎕ 속의 백혈구에서 나타나는 NBT의 환원양에 해당되는 흡광도를 microplate reader로 630 nm에서 측정하였으며 음성 대조군으로는 DMSO와 KOH만 첨가된 well을 이용하였다.

 대식세포의 활성을 측정하기 위해 L-15배지에 부유된 300 ㎕ 부피의 백혈구에 포르말린 처리된 E. coli 300 ㎕를 각각 혼합한 후 18℃에서 1시간 배양하였다. 그 후 0.9 ㎖의 차가운 PBS를 넣은 후 300×g에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 tube에 가라앉은 세포 펠릿을 취하여 slide glass에 도말 한 후 건조시켰으며 최종적으로 Giemsa 용액(Sigma, USA)으로 세포들을 염색 한 후 현미경으로 세포들을 관찰하였다. 대식세포활성은 100개의 세포 당 E. coli를 섭이한 세포의 수를 백분율로 표시하였다(Mathews 등, 1990).

9. 비 특이적 체액성 반응측정

 라이소자임 활성은 탁도의 정도를 기준으로 측정되었다. 즉 Micrococcus lysodeikticus(Sigma)를 0.2 ㎎/㎖의 농도로 0.05 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 부유시킨 후 측정하고자 하는 혈장 샘플 10 ㎕씩을 96-well plate에 200㎕씩 분주되어 있는 박테리아 부유액에 첨가하였다. 그 후 상온에서 1분과 4분 후에 각각 감소하는 흡광도를 520 nm에서 측정하였다. 라이소자임의 활성단위인 unit는 1분당 0.001의 흡광도를 감소시키는 혈장의 양으로 정의하였다.

 Alternative complement 활성은 Platts-Mills 등(1974)의 방법으로 측정하였다. Rabbit red blood cells(RαRBC)를 target cells로 하여 0.01 M ethyleneglycol tetraacetic acid-Mg-gelatin veronal beffer(EGTA-Mg-GVB)에 부유시켜 tilapia 혈청 내의 보체 활성을 측정하였다. 토끼의 귀정맥에서 혈액을 채취하여 Histopaque-1077을 사용하여 적혈구만을 분리하였으며 PBS로 200×g 에서 2회 세척한 다음 적혈구는 0.01 M EGTA-Mg-GVB에 희석하여 1×10⁸ cells/㎖의 농도로 조절하였다. 혈청은 1:20으로 EGTA-Mg-GVB에 희석한 다음 96 well plate에 200, 150, 125, 100 및 80 ㎕씩 분주하고 EGTA-Mg-GVB로 전체 부피가 200 ㎕가 되도록 맞추어주었다. 적혈구 0.1 ㎖(1×10⁸ cells/㎖)을 각각의 well에 분주하고 20℃에서 90분간 배양한 후 28×g 에서 5분 동안 원심분리 한 다음 상층액 100 ㎕를 취하여 micro plate reader를 이용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다. ACH₅₀ 값은 다음 공식으로 계산하였다.

 ACH₅₀ value(Unit/㎖)=1/Κ×혈청 희석 배수×0.5

10. 통계처리

 데이터는 평균과 표준편차로 표현하였으며 PRIMER(McGraw-Hill, Inc., ver.1.5)를 사용하여 두 그룹간의 평균차이 검증에는 t-test를 이용하여 분석하였다. 세 그룹 이상의 평균값은 one-way analysis of variance를 이용하여 Student-Newman-Keul’s test로 각 group간의 유의성을 검정하였다. 유의성의 판단 기준은 p<0.05로 하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

 본 연구에서는 급격한 수온의 변화가 틸라피아의 생리적 방어기전에 미치는 영향을 조사하고자 수온의 차이에 따라 배양된 틸라피아의 선천성 면역반응과 E. tarda로 공격감염시켰을 시 각 수온별로 나타나는 폐사율을 관찰하였다. 고수온에서 잉어의 아가미에 Flavobacteriumcolumnare가 훨씬 흡착감염이 잘되었으며(Decostere 등, 1999) 저 수온에서 송사리 일종인 Poecilia reticulater가 Tetrahymena sp.에 유의성 있게 감염이 잘되는 것으로 보고되고 있다(Leibowitz 등, 2005). 본 연구에서 S. iniae로 공격 감염시키지 않은 대조군의 틸라피아는 모두 살았지만 16℃ 및 36℃에서 감염시킨 지 1일 후 병적증상과 폐사가 나타나기 시작하였다. 폐사된 틸라피아는 S. iniae에 감염된 전형적인 증상 즉, 체색흑화, 체표면 양쪽의 출혈 및 지느러미의 울혈 등이 관찰되었다. 공격감염 시킨 후 2일부터 4일까지 16℃및 36℃에서 자란 틸라피아의 누적폐사율은 25℃의 것들보다 유의성있게 높게 나타났다(Fig. 1).

Fig. 1. Susceptibility of tilapia to S. iniae when transferred from 25℃ to 16℃ and 36℃. Values are mean±S.E.

 수온의 변화가 틸라피아의 선천성 면역반응에 미치는 영향을 조사해 본 결과 호흡폭발은 16℃에서 자란 틸라피아에서 24, 48 및 96시간 후에 각각 14%, 9% 및 13%까지 유의성 있게 감소되었으며 36℃에서는 24 시간 후에 12%, 48 및 96 시간 후에는 16%까지 유의성 있는 감소가 관찰되었다(Fig. 2).

Fig. 2. Mean (±S.E.) respiratory burst activity of tilapia kept at 25℃ at the beginning and after 12-96 h transfer to 16, 25 and 36℃. Data in the same exposure time with different letters are significantly different (p<0.05) among different temperatures.

 호흡폭발은 무지개 송어(rainbow trout O. mykiss)의 경우 수온이 상승함에 따라 비례적으로 증가한다고 하였으며(Nikoskelainen 등, 2004) 줄무늬 bass의 경우 26℃에서는 높았으나 23 및 29℃에서는 상대적으로 낮았다고 보고되었다(Carlson 등, 1995). 본 연구에서는 저 수온(16℃)과 고 수온(36℃)에서 자란 틸라피아에 있어서 24-96시간에 걸쳐 유의성 있게 호흡폭발이 감소되었다.

 대식세포의 활성은 16℃에서 자란 틸라피아에서 12 및 24시간 후 각각 31% 및 33%까지 유의성 있게 감소하였으며 36℃의 경우 12, 24, 48 및 96시간 후 각각 33%, 29%, 32% 및 26%까지 감소되었음을 알 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. Mean (±S.E.) phagocytic activity of tilapia kept at 25℃ at the beginning and after 12-96 h transfer to 16, 25 and 36℃. Data in the same exposure time with different letters are significantly different (p<0.05) among different temperatures.

 틸라피아가 25℃에서 12℃로 옮겨져 자랐을 때 대식세포활성이 유의성 있게 감소되었다고 보고(Chen 등, 2002)된 것처럼 본 연구에서도 낮은 수온(16℃)에서 12 및 24시간 후 유의성 있게 감소되는 비슷한 유형의 결과가 관찰되었다. 그러나 48시간 후 낮은 수온임에도 불구하고 정상수준으로 회복되었다. 이러한 결과는 낮은 수온의 변화에 따라 틸라피아가 적응되어 대식세포의 활성이 원 수준으로 회복될 수 있다는 사실을 암시해 준다. 그러나 고 수온(36℃)의 경우 12시간 후 감소하기 시작하여 96시간까지도 낮은 대식활성이 유지되는 것으로 보아 틸라피아가 저 수온보다는 고 수온의 스트레스에 더욱 예민하게 반응하는 것으로 생각된다.

 라이소자임 활성은 16℃에서 자란 틸라피아에 있어서 12, 24 및 48시간 후 각각 44%, 19% 및 28%까지 유의성 있게 감소하였으나 36℃의 경우 24시간 째 까지는 대조군에 비해 유의성 없는 차이를 보이다 48 및 96시간 후에는 각각 111% 및 161%까지도 유의성 있게 증가되었음을 관찰하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Mean (±S.E.) lysozyme activity of tilapia kept at 25℃ at the beginning and after 12-96 h transfer to 16, 25 and 36℃. Data in the same exposure time with different letters are significantly different (p<0.05) among different temperatures.

 보체의 활성은 16℃에서 자란 틸라피아에 있어 12시간 후 58%까지 유의성 있게 감소하였으며 36℃의 경우 24시간 후 16%까지 유의성 있게 증가 하였다(Fig. 5). 본 연구의 결과는 라이소자임, C-reactive protein 및 보체와 같은 체액성 선천인자들의 활성이 고 수온에 순치된 어류에 있어서 높게 관찰되었다는 보고(Langston 등, 2002; Holland 등, 2002; Nikoskelainen 등, 2004)와 유사하였다. Gilthead seabream인 S. aurata의 라이소자임 활성이 18℃에서 11℃로 옮겨졌을 때 유의성 있게 저하되었다(Tort 등, 1998; Tort 등, 2004).

Fig. 5. Mean (±S.E.) ACH50 of tilapia kept at 25℃ at the beginning and after 12-96 h transfer to 16, 25 and 36℃. Data in the same exposure time with different letters are significantly different (p<0.05) among different temperatures

 본 연구에서도 이전 결과와 유사하게 라이소자임의 경우 12-48 시간 후 틸라피아를 16℃의 낮은 수온으로 이동시켰을 때 그 활성이 감소되었으며 보체의 경우 16℃에서 12시간 경과되었을 때 그 활성이 감소됨을 관찰하였다.

 고 수온은 잉어의 아가미에 Flavobacterium columnare의 흡착을 증가시켰다는 보고(Decostere 등, 1999)가 있으며 구피는 저 수온에서 Tetrahymena sp에 쉽게 감염된다고 하였다(Leibowitz 등, 2005). 자연 감염된 무지개송어는 12-18℃의 고 수온에서 증폭신장병(proliferative kidney disease, PKD)증세를 보였으나 9℃의 저 수온에서는 그러한 증세가 관찰되지 않았다(Clifton-Hadley 등, 1986). 본 연구에서는 저 수온의 16℃나 고 수온의 36℃에 순치된 틸라피아가 S. iniae에 대한 저항성이 감소됨과 더불어 호흡폭발 및 대식세포활성이 감소됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 약 10℃ 정도로 낮게 또는 높게 수온 차가 발생하게 되면 틸라피아의 면역기능이 저하됨으로써 S. iniae에 대한 저항성이 감소될 수 있음을 암시 해준다.

사사

 이 논문은 2013년도 군산대학교 수산과학연구소 학술연 구비 지원으로 연구되었음