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Ⅰ. 서론

 생물종은 고대로부터 인류의 주요한 경제적 자원으로 사용되어 왔으며, 인류는 동물, 식물을 포함한 다양한 생물종으로부터 식량, 약품, 산업생산물 등 인류에게 유용한 생물자원을 선별하여 활용해 오고 있다. 동물유전자원은 농업 및 식량생산 뿐만 아니라 의약 및 산업소재로 이용되거나 향후 이용될 수 있는 동물 종, 집단, 품종 계통, 변종 및 유전적 재료 등을 포함한다(Choi 등, 2012).

 유전자원은 현재 또는 미래에 이용될 수 있는 유용 유전자를 가진 생물을 칭하며, 크게 식물, 동물 및 미생물 유전자원으로 나누어진다. 유전자의 다양성이란 동일한 종에 속하는 개체간의 유전적 차이를 의미하는데 각각의 생물종에 대하여 유전적 변이를 얼마나 많이 보유하는가에 따라 유전적 다양성의 증대를 가져올 수 있으며 이것은 유전자원이 풍부해짐을 뜻한다. 약 200여 년 전부터 생산 형질의 향상외모특성의 고정 등을 위한 선발 프로그램의 적용과 함께 우수한 능력을 지닌 소수 개량품종들의 세계적인 확산으로 생산성이 저조한 지역토착 품종은 멸종하거나 멸종위기에 처해있으며, 전 세계에서 보고된 가축 34종 7,616품종 가운데 9%(690 품종)는 멸종되었고, 20%(1,491 품종)는 멸종위험 상태에 처해 있다(FAO, 2007).

 국내의 재래가축 역시 외래품종의 도입으로 멸종의 위기를 맞았었지만 일부 농가에 의해 유지되어오던 소수의 재래가축이 2000년대 이후 축산관련 대학 및 연구소의 인공수정 및 수정란이식을 활용한 증식사업시행으로 칡소, 흑우 및 제주흑우의 완전한 멸종은 피할 수 있었다. 현재 전국적으로 칡소 1,500여두, 흑우 180 여두가 사육되고 있으며, 제주흑우는 제주특별자치도 내에서 300두가 사육되고 있다.

 국제식량농업기구(FAO: Food and Agriculture Organization)에서 구축한 가축다양성정보시스템(DAD-IS: Domestic Animal Diversity Information System, http://dad.fao.org)에는 한국 재래소 4품종(한우: Hanwoo, 칡소: Chikso, 흑우: Heugu, 제주흑우: Jeju black cattle)이 등재되어 있으며(Choi 등, 2012), 제주흑우는 2013년 7월 천연기념물 제546호로 지정되었다. 최근 한우를 제외한 멸종위기의 한국 재래소 3품종에 대한 관심이 증대되면서 분자생물학적 수준에서 이들 품종의 모색발현, 근내지방합성 및 계통유전학적 특성을 구명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(Park 등, 2012; Lee 등, 2013; Kim 등, 2013a).

 MS(microsatellite)는 non-coding 부위에 존재하는 짧고 단순한 염기서열이 반복되는 부분으로 유전체상의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편한 마커로써 집단유전학 및 가축 품종간의 근연관계 등에 널리 이용되는 DNA 마커이다(Tautz, 1989). Y 염색체상의 MS는 부계유전양상을 보이며 원칙적으로 재조합의 가능성이 없다(Hellborg와 Ellegren, 2004). 이러한 유전특징을 기초로 가축의 품종 비교연구, 계통유전학적 연구 및 동일 부계감정 등에 널리 이용되고 있다(Liu 등, 2002; Pérez-Pardal 등, 2010).

 Yoon 등(2007)은 한국재래소 및 외래소 822두를 대상으로 Bos indicus와 B. taurus 종간의 구별이 가능한 마커 INRA142의 유전자형을 분석한 결과, 한우, 칡소 및 흑우는 모두 B. taurus 유전자형을 지니고 있음을 증명하였으며, 한국 재래소의 기원은 기존의 B. indicus 와 B. taurus의 혼합설과는 달리 유럽계통의 B. taurus만으로 기원하였을 가능성을 제시 하였다.

 본 연구는 한국재래소 및 외래소 10품종 147두를 대상으로 Y 염색체 상에 위치한 6개 MS 좌위의 유전자 빈도 및 분포를 기반으로 부계 혈통에 근거한 한국재래소 및 외래소 품종간의 유전적 근연관계 및 특징을 조사하여 멸종위기에 처한 한국재래소 3품종의 증식 및 활용에 필요한 기초자료를 제시하고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료 및 DNA 추출

 본 연구를 위해 칡소, 흑우, 제주흑우 등 한국재래소와 홀스타인(Holstein Friesian), 샤로레(Charolais), 앵거스(Aberdeen Angus), 헤어포드(Hereford), 시멘탈(Simmental) 및 교잡종(한우×샤로레) 등 총 10품종 147두를 공시하였다(Table 1). 칡소는 강원 축산기술연구센터, 전북 축산위생연구소, 충북 축산위생연구소 등 3개 기관에서, 흑우는 충북 축산위생연구소에서, 제주흑우는 제주특별자치도 축산진흥원에서 사육되고 있는 개체의 혈액을 수집하였다. 칡소는 특유의 호반 무늬를 띠는 반면 흑우와 제주흑우의 모색은 전체적으로 흑색을 보인다(Fig. 1). 또한 칡소 및 흑우는 우리나라 본토에, 제주흑우는 제주도에만 사육된다는 지역적 특징도 존재한다(Table 1). 외래품종 및 교잡종 시료는 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 수집·보존 중인 정액을 사용하였다. DNA 추출은 Sucrose-Proteinase K 방법(Birren 등, 1997)을 이용하였다.

Table 1. Description of the ten cattle breeds used in the present study

Fig. 1. Different coat color phenotypes of the Korean native cattle breed: (a) Chikso, (b) Heugu, © Jeju black.

2. Y 염색체상의 MS 좌위 PCR

 소의 Y 염색체 상에 존재하는 MS 좌위는 기존에 보고된 6개의 마커를 선별하여 각 forward primer 5’ 끝 부분에 형광 염색 표지가 부착되도록 제작하였으며, 자세한 primer 정보 및 참고문헌 등은 Table 2에 제시하였다. 2개의 multiplex 조합(a=BM861, INRA124, UMN0103; b=INRA189, UMN0307, UMN0504)을 만든 후 Accupower-Dye PCR PreMix(Bioneer, Korea)를 이용 반응액 총량을 20 ㎕로 맞춘 후 C1000 Thermal Cycler(Bio-Rad, USA)를 이용하여 multiplex PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation을 1회 실시하고, 95℃에서 60초 denaturation, 57-58℃에서 40초 annealing, 72℃에서 60초 extension을 35회 반복한 다음 72℃에서 15분 동안 final extension을 실시하였다.

Table 2. Information of six Y-chromosomal microsatellite markers used in this study

3. 유전자형 결정

 PCR 산물은 Hi-Di Foramide와 GeneScan 500 Liz size standard(Applied Biosystems, USA)를 혼합하여 95℃에서 10분간 denaturation 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용하였다. MS 마커에 대한 대립유전자의 크기 결정은 GeneMapper(version 4.0) software(Applied Biosystems, USA)를 이용하였고, 그 결과는 Microsoft Excel ver. 2007(Microsoft, USA)을 이용하여 품종별로 취합한 후 각 통계 분석 방법에 적용 하였다.

4. 통계 분석

 MS tool Kit(Park, 2001)를 이용하여 6개 MS 좌위별 대립유전자의 빈도를 계산하였고, 품종간의 유전거리는 DISPAN(Ota, 1993) 과 SPLITS TREE(Huson, 1998)을 이용하여 Nei 등(1983)의 방법에 따라 D_A 유전거리 계산 및 Neighbor-Joining tree를 작성 하였다.

 공시된 10개 품종에 대한 유전적 균일성 및 실제 분포추정은 STRUCTURE (Pritchard 등, 2000)를 이용하여 분석하였다. 먼저 분류 가능한 집단 수 (K 값)를 추정하기 위해 각 K(K=2-10) 값에 대한 평균 추정치 Pr(X|K)와 표준편차를 계산하고, buri-in 20,000회, MCMC(markov chain monte carlo) 반복 수 100,000회, 이를 30회 반복하여 계산된 결과를 Evanno 등(2005)의 방법이 적용된 STRUCTURE HARVESTER(Earl와 Holdt, 2012)를 사용하여 ΔK 값을 계산하여 최적의 K 값을 결정 하고, 각 클러스터에 대한 집단의 실제분포를 추정 하였다. CLUMPP(Jakobsson와 Rosenberg, 2007)를 이용하여 30회 반복한 각 K(K=2-10)값의 결과의 평균치를 계산하고 그 결과를 DISTRUCT(Rosenberg, 2004)를 이용하여 도식화 하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

 본 연구에서 공시한 10품종 147두의 Y 염색체 상에 분포하는 6개 MS 좌위에 대한 유전자형 분석결과를 Table 3에 제시하였다. 4개의 MS 좌위(BM861, INRA124, INRA189, UMN0504)는 모두 단일 대립유전자(allele)를 나타냈으며, UMN0103 및 UMN0307은 각 4개, 3개의 대립유전자를 보였다. UMN0103 좌위에서 한국 재래소 3품종(CS, HU, JJ)은 132 bp, 유럽소 3 품종(HS, AA, HF)은 126 bp, CH, SM 및 CH와 한우 교잡종은 134 bp로 각 품종별로 단일 대립유전자를 나타낸 반면 일본품종 JB는 3개의 대립유전자를 나타냈다. UMN0307 좌위 역시 일본품종인 JB에서 가장 많은 3개의 대립유전자를 나타냈고, 2개의 대립유전자를 나타낸 CR과 AA는 소수의 개체만 다른 대립유전자를 보였으며, 그 외의 나머지 품종들에서는 품종별로 단일 대립유전자를 나타냈다.

Table 3. Allele variability and frequencies of six Y-chromosomal microsatellite loci in ten breeds

 Hanotte 등(1997)은 4품종 101두를 대상으로 INRA124 유전자형을 분석한 결과, B. indicus종에는 130 bp의 대립유전자만, B. taurus종에서는 132 bp의 대립유전자만 존재한다고 보고하였으며, Yoon 등(2007)이 보고한 동북아시아 및 유럽품종 분석 결과는 본 연구와 동일하게 모두 132 bp의 대립유전자만 관찰되었다. 이 같은 결과는 이전 연구에서 보고되지 않은 제주흑우의 기원 역시 B. indicus종의 혼합없이 B. taurus만으로 기원하였을 가능이 높음을 시사한다.

 Ginja 등(2009)은 B. indicus 및 B. taurus종을 포함한 35품종 748두를 대상으로 Y염색체 특이 MS 좌위 6개를 분석한 결과, UMN0504의 대립유전자는 모든 품종에서 동일하게 144 bp만을 나타냈고, BM861과 INRA124의 대립유전자에 따라 B. indicus와 B. taurus종을 명확히 구분할 수 있다고 보고했다. 본 연구에서 분석에 이용된 10개의 소 품종은 모두 B. taurus종에 속하며, 분석 결과에서 분석 개체 모두 B. taurus종에서 나타나는 대립유전자만이 확인되었다. 따라서 본 연구의 결과는 Ginja 등(2009)이 보고한 결과와 일치하였다.

 6개 MS 좌위에 대한 유전자형 분석 결과를 이용하여 품종 간의 DA 유전거리를 산출한 후 NJ tree를 작성하였다. NJ tree 상에서 10개 품종은 크게 3개의 특징적인 그룹으로 분류되었다(Fig. 2). 세부적으로, 외래품종 중 HL, AA, HF 및 JB가 하나의 그룹을 형성하였고, CR, HC 및 SM이 다른 하나의 그룹을 형성하였다. 또한 우리 재래소인 CS, HU, JJ는 외래 품종에서 나타난 2개 그룹과 독립적인 그룹을 형성하였다. 이러한 분류는 B. taurus종 내에서 우리 재래소가 유럽 및 일본 유래 소 품종과는 다른 부계기준의 계통 유전학적 특성을 보유하고 있다는 것을 보여주는 것이다. 따라서 본 결과는 우리나라 재래소-특이 유전적 특성이 존재함을 뒷받침할 수 있는 과학적 근거로 활용 가능 할 것으로 판단된다.

Fig. 2. Neighbor-Joining tree showing the genetic divergence among 10 cattle breeds, using Nei’s D_A genetic distance on the basis of alleles frequencies from 6 Y-chromosomal microsatellites. The number in the branch indicates the percentage occurrence in 1000 bootstrap replicates. Abbreviations see Table 1.

 부계 혈통을 기반으로 분석된 개체들이 실제 몇 개의 그룹으로 분류가 가능한지를 추정하기 위해 STRUCTURE software로 K 값을 2에서 7까지 설정하여 30회 반복 분석하고, 그 결과를 Evanno 등(2005)의 방법으로 최적의 K, 즉 실제 분류 가능한 그룹 수를 의미하는 ΔK 값을 계산한 결과, K=3에서 가장 높은 수치(381.41)를 보였다(Table 4). 이 결과는 분석된 10개 품종의 부계 혈통은 3개 그룹으로 분류가 가능함을 의미한다. CLUMPP와 DISTRUCT software로 30회 반복하여 분석한 후 결과의 평균을 계산하고 그 결과를 도식화하여 Fig. 3에 제시하였다. 최적의 K=3에서는 HL, AA 및 HF가 하나의 그룹을 형성하고, CR, SM 및 한우와 CR 교잡종인 HC가 다른 하나의 그룹을 형성 그리고 한국 재래종 3품종이 또 다른 하나의 그룹을 형성하는 결과를 나타냈다. Table 5는 분석된 147두의 개체들을 3개의 클러스터로 가정하여 분류할 경우의 유전적 균일성 추정 결과를 나타내고 있는데, 일본품종 JB는 2번과 3번 클러스터에 각 57.9 및 36.9%의 균일성을 나타냈으며, 그 밖의 9개 품종은 모두 90% 이상의 높은 균일성을 나타냈다. 1번 클러스터에는 한국 재래소 3품종(CS, HU, JJ), 2번 클러스터에는 HS, AA, HF품종, 3번 클러스터에는 CR, SM 및 한우와 CR 교잡종이 90% 이상의 높은 균일성을 나타낸 반면, 일본품종 JB는 2번과 3번 클러스터에 각 57.9 및 36.9%의 균일성을 보였다. 이 같은 결과는 JB품종 형성과정에서 유럽 유래 품종(Devon, Shorthorn, Brown swiss)과의 교잡(Suekawa 등, 2010)에 의한 결과로 추정된다.

Table 4. The estimated Delta K values by Evanno method (2005)

Table 5. Population of membership of each of the ten breed genotypes, with six Y-chromosomal microsatellite markers in the three inferred clusters using STRUCTURE analysis

Fig. 3. Graphs of 147 individual Q-matrices obtained with STRUCTURE, CLUMPP and DISTRUCT softwares for K=2 and 3 groups. Individuals were ordered by populations and separators between them were included. The length of each colored segment is equal to the estimated proportion of the individual’s membership in the cluster of the correspondent color. Abbreviations see Table 1.

 부계 혈통을 기반으로 집단 간의 유전거리, Bayesian법에 의한 군락 분류 및 유전적 균일성 추정결과를 종합하면, B. taurus종에 속하는 칡소, 흑우, 제주흑우의 기원에 있어 B. indicus종의 유전적 유입이 없었을 가능성을 제기하며, 최근 한국 재래소를 대상으로 모계혈통 확인을 목적으로한 mtDNA 분석 연구(Kim 등, 2013a; Kim 등, 2013b) 또한 이와 유사한 결과를 제시했다. 본 연구에서 확인된 칡소, 흑우, 제주흑우의 부계 유전특성은 재래소의 진화적 기원 추정과 함께 재래소와 외래 품종들의 차별화를 위한 과학적 근거자료로 활용이 가능할 것으로 판단된다. 본 연구의 결과를 기초로 향후 보다 다양한 품종의 시료를 수집하여 부계 및 모계혈통을 동시에 분석다면 보다 명확한 한국 재래소의 기원 추정이 가능할 것으로 사료된다.

사사

 본 연구는 농촌진흥청 연구개발사업 어젠다(15-52) 과제(과제번호: PJ008431) 지원으로 수행된 연구결과이며, 이에 감사드립니다.